Smad3对非小细胞肺癌A549细胞和宫颈癌HeLa细胞迁移的影响

韦荣飞，李梦媛，杨星九，朱瑞敏，徐大模，高 苒

(中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，北京 100021)

Smad3对非小细胞肺癌A549细胞和宫颈癌HeLa细胞迁移的影响

韦荣飞，李梦媛，杨星九，朱瑞敏，徐大模，高 苒*

(中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，北京 100021)

目的 过表达、敲低或抑制Smad3的活性，探讨Smad3对非小细胞肺癌A549细胞和宫颈癌HeLa细胞迁移的影响。方法 设计扩增Smad3基因全长编码序列cDNA的引物，通过分子克隆技术构建pCMV-Myc-Smad3过表达载体，同时设计并合成靶向Smad3的siRNA序列，在A549和HeLa细胞中过表达或敲低Smad3，或者利用Smad3的抑制剂SIS3 2 μM处理细胞，采用细胞划痕的方法研究Smad3对A549和HeLa细胞迁移的影响。结果 利用分子克隆技术成功构建pCMV-Myc-Smad3过表达载体。过表达Smad3促进A549和HeLa细胞的迁移。敲低Smad3抑制A549和HeLa细胞的迁移。SIS3抑制Smad3的活性导致A549和HeLa细胞的迁移速率变慢。结论 Smad3促进A549和HeLa细胞的迁移。

Smad3；过表达载体；RNA干扰；SIS3；细胞迁移

TGF-β(transforming grpwth factor beta，转化生长因子β)信号通路是调节细胞生长的重要的信号通路，机体对TGF-β信号通路响应的敏感性降低，将会导致肿瘤的形成[1]。经典的TGF-β信号通路由TGF-β I型和II型受体(TGFBR1，TGFBR2)介导，TGFBR1和TGFBR2与TGF-β结合后能够磷酸化下游R-Smads(receptor-activated Smads)蛋白，包括Smad2和Smad3[2,3]。激活的R-Smads蛋白随后与Smad4结合并转移至细胞核中调控基因的转录[4-6]。正常的生理条件下，在多种组织器官中，包括乳房组织，Smad3能够抑制细胞的增殖并促进细胞凋亡，而在乳腺癌晚期，Smad3能够促进乳腺癌细胞的转移[7]。2015年，Rodney B Luwor等在MolecularCancer杂志发表文章揭示，与非迁移细胞相比，迁移的人乳腺癌MDA-MB-231细胞中，Smad3具有更高的活性[8]。除了乳腺癌细胞，Smad3是否也能影响其他类型的癌细胞的迁移呢？为探讨该科学问题，我们通过构建pCMV-Myc-Smad3过表达载体，检测过表达Smad3后对宫颈癌HeLa细胞和非小细胞肺癌A549细胞迁移的影响。同时，通过RNAi干扰及Smad3抑制SIS3处理细胞敲低Smad3的蛋白水平或抑制Smad3的活性，进一步验证Smad3对宫颈癌HeLa细胞和非小细胞肺癌A549细胞迁移的影响。

1 材料和方法

1.1 细胞及主要试剂

载体构建PCR引物由上海维基生物科技有限公司合成；Taq polymerase、dNTP购自宝生物工程(大连)有限公司；限制性内切酶Sal I、Not I及T4 DNA连接酶购自美国NEB公司；感受态细胞DH5α购自天根生化科技(北京)有限公司；质粒提取盒购自德国Qiagen公司；胎牛血清、DMEM、胰酶购自美国Gibco公司；RIPA裂解液购自Sigma公司；蛋白Marker及发光底物购自Thermo公司；Lipofectamine 2000及RNAiMax转染试剂购自Life Technologies公司。HEK-293T、HeLa和A549细胞系为本实验室所冻存。

1.2 实验方法

1.2.1 pCMV-Myc-Smad3过表达载体的构建

1.2.1.1 Smad3 DNA目的片段的获得

提取HeLa细胞的总RNA，并进行cDNA扩增；根据CDS序列(NM_005902.3)设计含有Sal I和Not I限制性内切酶位点的引物序列；以反转录的Smad3 cDNA作为模板，扩增Smad3 DNA目的片段，条件为95℃预变性5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min 20 s，共35个循环，72℃ 5 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外灯下切割含有目的条带的凝胶块，利用凝胶回收试剂盒回收目的片段。

1.2.1.2 酶切

利用Sal I和Not I限制性内切酶对PCR获得的Smad3 DNA目的片段及pCMV-Myc-vector进行酶切，酶切条件为37℃ 过夜。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外灯下切割含有目的条带的凝胶块，利用凝胶回收试剂盒回收目的片段。

1.2.1.3 连接及转化

利用T4 DNA连接酶将酶切回收后的Smad3 DNA片段和线性pCMV-Myc-vector进行连接，连接条件为16℃过夜。连接产物转化感受态DH5α细胞，在含有氨苄霉素的LB平板上筛选克隆。挑取阳性克隆，过夜摇菌扩增。

1.2.1.4 质粒提取、酶切鉴定及测序

利用质粒提取试剂盒提取阳性菌中的质粒。采用Sal I和Not I限制性内切酶对重组质粒pCMV-Myc-Smad3进行双酶切鉴定，并以1%琼脂糖凝胶电泳验证片段大小，同时对重组质粒进行基因测序鉴定。

1.2.1.5 HeLa细胞和A549细胞的培养

HEK-293T、HeLa和A549细胞培养基为含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM高糖培养基。培养于37℃，5% CO2的细胞培养箱。

1.2.1.6 质粒的表达检测

用胰酶将HEK-293T细胞消化成单细胞悬液并对24孔板进行铺板，24 h后，通过Lipofectamine 2000将0.8 μg的pCMV-Myc-vector和重组质粒pCMV-Myc-Smad3分别转染。24 h后，RIPA裂解液裂解细胞，加入等体积的2×loading buffer，沸水煮15 min，得到蛋白样品。随后利用Myc标签抗体进行Western blot检测重组质粒pCMV-Myc-Smad3的表达情况。

1.2.2 划痕实验

用胰酶将HeLa和A549细胞消化成单细胞悬液并对6孔板进行铺板，24 h后，通过Lipofectamine 2000或RNAiMax转染试剂将3 μg的重组质粒pCMV-Myc-Smad3或Smad3的siRNA分别进行转染。40 h后，用20 μL枪头沿直线对6孔板中长满的细胞进行划痕，0 h、24 h及48 h时分别拍照记录细胞的迁移情况。Smad3抑制剂SIS3(工作浓度2 μM)加入细胞培养基中培养细胞，划痕及记录方法同上。

1.3 统计学方法

细胞迁移划痕实验每个时间点随机选取5个视野拍照，并利用ZEN 2软件测量划痕间距，以时间点0 h划痕宽度作为标准即100%，其他时间点划痕间距与0 h划痕间距的比值即为该时间点划痕两侧的相对距离(百分比)，相对距离越小，则说明相对迁移速率越大。利用Graphpad Prism 7对结果进行t检验，P< 0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 pCMV-Myc-Smad3过表达载体的构建

Smad3蛋白由425个氨基酸组成，其主要包含两个结构域：MH1和MH2结构域(图1A)。MH1和MH2对于Smad3正常生物学功能的发挥至关重要。我们以cDNA作为模板，用引物Smad3-F/R(表1)进行扩增，选择Sal I和Not I分别为上下游内切酶切割位点(图1B)，得到与预期片段大小相符的特异性片段(图2A)。利用Sal I和Not I对PCR产物进行酶切后，通过T4 DNA连接酶将酶切产物连接至pCMV-Myc载体上。经测序比对及图2B酶切鉴定结果显示，Smad3 DNA全长片段已成功插入pCMV-Myc载体上。如图2C，Western blot结果显示，与HEK-293T细胞中只转染了Myc-vector的对照组相比，转染Myc-Smad3过表达质粒24 h后，在约55 kDa大小处检测到Smad3的过表达条带，表明pCMV-Myc-Smad3过表达载体构建成功。

表1 pCMV-Myc-Smad3过表达载体构建所需引物

注：(A)为Smad3蛋白的结构示意图，主要包括MH1和MH2结构域；(B)为pCMV-Myc-Smad3过表达载体构建示意图，其中，选取Sal I和Not I分别为上下游限制性内切酶切割位点。图1 Smad3蛋白和pCMV-Myc-Smad3过表达载体构建示意图 Note.(A)indicates the structure diagram of Smad3, including MH1 and MH2 domain;(B)indicates the plasmid profile of pCMV-Myc-Smad3.Fig.1 Structure diagram of Smad3 and pCMV-Myc-Smad3 plasmid construction.

注：(A)为利用引物Smad3-F/R扩增Smad3 DNA片段；(B)为Sal I/Not I酶切鉴定pCMV-Myc-Smad3质粒；(C)为HEK-293T细胞中转染pCMV-Myc-Smad3过表达质粒，Myc-vector作为阴性对照，利用Myc标签抗体进行Western blot检测Smad3的过表达情况。图2 pCMV-Myc-Smad3过表达载体的构建及蛋白表达检测Note.(A)indicates PCR for amplification of Smad3 DNA;(B)indicates the restriction enzyme digestion for pCMV-Myc-Smad3 by Sal I + Not I;(C)indicates the detection of protein expression level of pCMV-Myc-Smad3 in HEK-293T by Western blot.Fig.2 Construction of pCMV-Myc-Smad3 plasmid

2.2 Smad3抑制剂SIS3对非小细胞肺癌A549细胞和人宫颈癌HeLa细胞迁移的影响

SIS3是Smad3的抑制剂，其能有效抑制Smad3的磷酸化，进而阻止Smad3进入细胞核参与基因的转录调控。为研究SIS3对细胞迁移的影响，首先，在A549细胞中检测SIS3对Smad3的抑制作用，以证明SIS3的活性。如图3所示，SIS3能够有效抑制Smad3的磷酸化。与DMSO处理组相比，含2 μM SIS3的DMEM培养基培养细胞，划痕后0、24、48 h，A549(图4A)和HeLa(图4B)细胞迁移结果显示，SIS3能够有效抑制细胞的迁移。

注：上图分别为2 μM SIS3处理A549细胞(A)和HeLa细胞(B)后进行划痕，0、24、48 h时拍照观察细胞的迁移情况并进行统计学分析，DMSO处理组作为对照组。与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P < 0.001。图4 Smad3抑制剂SIS3能够有效抑制A549细胞和HeLa细胞的迁移Note. The above results indicate the inhibitor of Smad3, SIS3, significantly inhibits cell migration of A549 (A) and HeLa (B) cells;*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，compared with the normal group.Fig.4 The inhibitory effect of SIS3 on cell migration of A549 and HeLa cells

注：上图为Western blot检测A549细胞中Smad3抑制剂SIS3对Smad3活性(磷酸化)的抑制作用。图3 Smad3抑制剂SIS3对Smad3活性的抑制效应Note. The above result shows the inhibitor of Smad3, SIS3, has significant inhibitory effect on Smad3 activity. Fig.3 The inhibitory effect of SIS3 on Smad3

2.3 敲低或过表达Smad3对A549和HeLa细胞迁移的影响

如图5所示，与对照组相比，通过RNAi干扰技术敲低A549(图5A)和HeLa(图5B)细胞中内源的Smad3后，划痕后0、24、48 h细胞迁移结果显示，敲低Smad3明显抑制细胞的迁移。相反，在A549(图5A)和HeLa(图5B)细胞中过表达Smad3，划痕后0、24、48 h细胞迁移结果显示，过表达Smad3明显促进细胞迁移。以上结果表明，Smad3促进A549和HeLa细胞的迁移。

注：上图分别为A549细胞(A)和HeLa细胞(B)中敲低或过表达Smad3后进行划痕，0、24、48 h时拍照观察细胞的迁移情况并进行统计学分析，Con组作为对照组。与对照组比较，*P< 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。图5 敲低或过表达Smad3能够明显抑制或促进A549细胞和HeLa细胞的迁移Note. The above results show silencing of endogenous Smad3 or overexpression of Smad3 in A549 (A) or HeLa(B)cells can effectively inhibits or promotes cell migration;*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，compared with the normal group.Fig.5 Knockdown or overexpression of Smad3 inhibits or promotes cell migration

3 讨论

癌症是导致人类死亡的主要疾病之一，其中，约90%以上的癌症患者死于癌细胞的转移。近年来，人们对肿瘤形成的分子机制展开了大量的研究，为人类治疗癌症提供了多个潜在的治疗靶点[9-11]。前期报道揭示，TGF-β与多种肿瘤的发展密切相关，包括神经胶质瘤、乳腺癌等[12-14]。在正常的生理条件下，TGF-β信号能够抑制上皮细胞的增殖，然而，在肿瘤的发展进程中，TGF-β则诱导肿瘤细胞的增殖、侵袭及血管生成[15,16]。Smad3是TGF-β信号通路中的一个重要分子，前期报道揭示，在乳腺癌晚期，Smad3异常活化，促进乳腺癌细胞的转移[7,8]。SIS3作为Smad3的抑制剂，能够抑制TGF-β1诱导的Smad3的磷酸化及Smad3-Smad4的相互作用，进而抑制相关基因的转录[17]。本研究通过过表达、敲低Smad3或利用SIS3处理A549和HeLa细胞抑制内源Smad3的活性，然后检测细胞迁移能力的变化，从而阐明Smad3对非小细胞肺癌和宫颈癌细胞迁移的影响，结果显示，Smad3促进A549和HeLa细胞的迁移。Smad3调控细胞迁移的详细作用机制有待深入研究。

综上所述，结合前期相关报道，我们发现，Smad3不仅能够促进乳腺癌细胞的迁移，也能促进非小细胞肺癌和宫颈癌细胞的迁移。这提示，在人类多种肿瘤类型中，Smad3促进肿瘤细胞的迁移具有一定的普遍性。因此，后续靶向Smad3活性抑制药物的开发将具有很大的临床应用前景，也为肿瘤治疗提供新的途径。

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Effect of Smad3 on cell migration of A549 and HeLa cells

WEI Rong-fei, LI Meng-yuan, YANG Xing-jiu, ZHU Rui-min, XU Da-mo, GAO Ran*

(Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences &Comparative Medical Center, Peking Union Medical College, Beijing 100021，China)

Objective To investigate the effect of Smad3 on cell migration of A549 and HeLa cells. Methods Primers for pCMV-Myc-Smad3 plasmid construction and siRNA targeting Smad3 were designed and synthesized. pCMV-Myc-Smad3 plasmid was constructed with molecular cloning techniques. Overexpression of Smad3 with Myc-tag or silencing of endogenous Smad3, and then scratch assay was used to detect the migration ability of A549 and HeLa cellsinvitro. Results pCMV-Myc-Smad3 plasmid was successfully constructed. Overexpression of Smad3 significantly up-regulated the migration rate of A549 and HeLa cells. Conversely, in the same cells, silencing of endogenous Smad3 or treatment with Smad3 inhibitor, SIS3, down-regulated the migration rate. Conclusions Smad3 promotes cell migration of A549 and HeLa cells.

Smad3; Overexpression vector; RNAi; SIS3; Cell migration

协和青年基金资助，中央高校基本科研业务费专项资金资助(3332016077)；中国医学科学院医学实验动物研究所基本科研业务费专项资助(2016ZX310033)；北京市优秀人才培养项目(2015000020124G073)。

韦荣飞(1990-)，女，助理研究员，研究方向：免疫与肿瘤。E-mail: weirongfei2010@163.com

高苒(1980-)，女，副研究员，研究方向：肿瘤学、免疫学。E-mail: E-mail: gaoran26@hotmail.com

研究报告

R-332

A

1671-7856(2017) 01-0011-05

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.01.003

2016-06-14