参芪五味子片对阿尔茨海默小鼠的治疗作用及其对小鼠血清与海马体氧化应激水平的影响

艾 亮

参芪五味子片对阿尔茨海默小鼠的治疗作用及其对小鼠血清与海马体氧化应激水平的影响

艾 亮

目的 研究参芪五味子片对阿尔茨海默小鼠的治疗作用及其对小鼠血清和海马体氧化应激水平的影响。方法 选取50只3月龄APP小鼠，随机平均分为模型组,阳性药组,高、中、低剂量组；另选取10只C57BL/6小鼠作为空白组。阳性药组每天灌胃给予多奈哌齐(10 mg/kg)，高、中、低剂量组每天分别灌胃给予1.44、0.72、0.36 g/kg参芪五味子片，空白组和模型组则灌胃给予等量生理盐水，饲养时间为2个月。采用水迷宫实验检测各组小鼠学习与记忆能力；实验结束后取各组血清与海马体，检测其超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-Aoc)与谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平；利用末端标记法(TUNEL法)观察小鼠海马区细胞凋亡的情况。结果 高、中剂量组的潜伏期明显短于模型组，第3象限时间明显长于模型组，SOD、T-Aoc、GSH-Px水平明显高于模型组，MDA明显低于模型组；TUNEL染色显示，模型组与低剂量组小鼠出现较多的阳性染色的神经元，而在高、中剂量组中仅观察到少量的凋亡神经元。结论 参芪五味子片对阿尔茨海默病小鼠具有较好的治疗作用，可有效改善氧化应激水平，值得进行深入研究。

参芪五味子片；阿尔茨海默病；氧化应激

0 引言

阿尔茨海默病(Alzheimer′s diseases，AD)又称老年性痴呆，是临床最为常见的中枢神经系统退行性疾病之一，该病的主要临床表现为记忆力降低、人格改变、语言障碍及认知功能减退等[1]。目前，AD的具体发病机制仍不明确，其主要的病理特征为神经元中出现神经元纤维缠结、老年斑沉积及海马体中神经元数目降低等[2]。近年来，诸多研究结果提示，海马体氧化应激出现紊乱可能是导致AD发生及发展的一类关键因素[3]。参芪五味子片具有宁心安神、健脾益气的功效，常用于健忘、心悸气短、少寐多梦及倦怠乏力等症[4]。现代药学研究证实，该药物具有较强的抗氧化、抗衰老及提高记忆力等活性[5]。尽管临床针对参芪五味子片的研究较为广泛，但对其治疗AD的相关研究则较少涉及。APP小鼠(APP/V717转基因小鼠)是药物研究中较为成熟的AD模型[6]，本研究通过观察参芪五味子片对APP小鼠的治疗效果，为该药物的临床使用及AD的治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验主要试剂 参芪五味子片(康县独一味生物制药有限公司，国药准字Z20103006，批号：2015020129)；多奈哌齐为本研究中阳性药，购自美国Sigma公司，批号:98089212；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-Aoc)与谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)检测所需试剂盒均购自武汉博士德有限公司，批号:2014110313、2014122632、2015023052、2015022351；末端标记法(TUNEL法)试剂盒购自罗氏公司，批号:90082325；Western印迹抗体购于美国Sigma公司，批号:98061383。

1.2 实验动物分组方法 50只APP小鼠，3月龄，体重(18.0±2.0)g，购于陕西省疾控中心动物中心，实验动物合格证编号:SCXK(陕)2014-0122。根据参考文献中相关方法，另选择10只C57BL/6野生鼠作为本研究中空白对照小鼠，3月龄，体重范围(18.0±2.0)g，购自陕西省疾控中心动物中心，实验动物合格证编号:SCXK(陕)2013-1257。上述实验动物均由西安交通大学药学院实验动物中心饲养，饲养条件为55%湿度、标准饲养、日常光照及自由饮水，本研究中的动物实验操作流程均严格遵循《实验动物保护条例》[7]中相关规定。10只C57BL/6野生鼠为空白组，50只APP小鼠随机平均分为阳性药组、模型组、高剂量组、中剂量组及低剂量组，每组均为10只。

1.3 给药方法 参考相关文献[8]中对于参芪五味子片小鼠中枢神经系统疾病研究的一般给药剂量，本课题中，高、中、低剂量组小鼠每天分别灌胃给予1.44、0.72、0.36 g/kg参芪五味子片；阳性药组则每天灌胃给予10 mg/kg多奈哌齐；空白组与模型组每天灌胃给予等量生理盐水。各组给药时间均为2个月。

1.4 Morris水迷宫方法 采用Morris水迷宫检测各组小鼠学习与记忆能力，将水迷宫划分为4个象限，在第3象限(目标象限)中放置一个位于水面下0.8 cm的平台(直径30 cm)，实验过程中平台与水迷宫的位置均保持不变。

各次实验中，将小鼠由第1、2、4象限分别放入水池，并训练小鼠顺利找到平台，记录小鼠找到平台的时间(潜伏期)。若2 min内小鼠仍未找到平台，则应引导小鼠游至平台，且于平台停留1 min以强化记忆。各组小鼠均连续训练5 d，每天记录小鼠潜伏期，在训练的第6天撤去平台，对各组小鼠穿越平台所在位置的次数与第3象限停留时间进行检测。

1.5 小鼠血清及海马体中氧化应激水平的检测方法 水迷宫实验完成后，利用尾静脉取血法取各组小鼠静脉血并分离血清，取血完成后，利用颈椎脱臼法处死小鼠，取其海马体平均分为2份，留取一份备用，将另一份海马体置于生理盐水中，利用玻璃匀浆器将其制备成10%的组织匀浆，在高速离心机中离心10 min(3 000 r/min)后吸取其上清液，根据相关试剂盒说明书中方法，分别对血清及匀浆中SOD、MDA、T-Aoc、GSH-Px含量进行检测。

1.6 小鼠海马体细胞凋亡情况检测 取“1.5”项中海马体组织，固定并利用蜡块切片，根据TUNEL法试剂盒说明书中相关方法，采用末端标记法检测各组小鼠海马体细胞凋亡情况，其中凋亡的神经元细胞显棕褐色。

1.7 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行数据分析，分别采用t检验和单因素方差分析进行两两相比较及组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 参芪五味子片对AD小鼠学习与记忆能力的影响 在第1天的训练中，除空白组外，其他各组小鼠潜伏期基本一致(P>0.05)，空白组潜伏期较其余各组缩短(P<0.05)。在第2～5天的训练中，各组潜伏期均呈降低趋势，且阳性药组、高剂量、中剂量及空白组小鼠的潜伏期较模型组缩短，各组分别与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 各组水迷宫潜伏期结果比较

在第6天的训练中，阳性药组、高剂量组、中剂量组及空白组小鼠穿越平台所在位置的次数均明显多于模型组，且第3象限停留时间较模型组延长，各组分别与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠第3象限停留时间及穿越平台次数比较

注：*与模型组比较

2.2 参芪五味子片对AD小鼠血清氧化应激水平的影响 空白组、阳性药组、高剂量组、中剂量组小鼠血清中SOD、GSH-PX、T-Aoc的水平均明显高于模型组，而MDA低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2、表3。

2.3 参芪五味子片对AD小鼠海马体氧化应激水平的影响 空白组、阳性药组、高剂量组、中剂量组小鼠海马体中SOD、GSH-PX、T-Aoc的水平均明显高于模型组，MDA低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4、表5。

2.4 各组小鼠TUNEL染色结果 模型组及低剂量组小鼠海马体中存在较多阳性染色的神经元细胞，且其细胞核主要呈现固缩深染与棕黄色；空白组中几乎无上述阳性染色的神经元细胞；而在阳性药组、高剂量组及中剂量组中存在少量的且呈散在的凋亡神经元细胞。见图2。

表2 各组小鼠血清SOD、MDA比较

注：*与模型组比较

表3 各组小鼠血清T-Aoc、GSH-Px比较

注：*与模型组比较

表4 各组小鼠海马体中SOD、MDA比较

注：*与模型组比较

表5 各组小鼠海马体中T-Aoc、GSH-Px比较

注：*与模型组比较

图2 各组小鼠TUNEL染色结果(×400)

3 讨论

AD是一种多发于老年患者的中枢神经系统疾病，其起病隐袭且呈慢性进行性发展，患者主要表现为认知功能障碍、记忆障碍等精神神经症状，严重影响其生活质量，最终导致患者死亡[9]。尽管AD的具体发病机制尚不明确，但有较多的研究结果显示，该病的发生可能与机体氧化应激紊乱密切相关[10]。参芪五味子片是临床常用的中枢神经系统疾病治疗药物，主要成分包括南五味子、党参、黄芪及酸枣仁等，全方具有宁心、安神、健脾及益气的功效，适用于健忘、失眠、心悸、气短、多梦、乏力及自汗等症，在临床上被广泛应用于神经衰弱、焦虑及失眠等疾病的治疗[11-12]。现代药学研究证实，方中南五味子、党参及黄芪均是临床常用的滋补药，对中枢神经系统氧化应激紊乱均具有较好的调节作用，尤其是五味子及酸枣仁，可有效修复过氧化所致的中枢神经系统损伤[13]。APP小鼠是AD研究中常用的一种模型，而其野生型C57BL/6小鼠则多作为空白对照被广泛应用[14]。

本研究采用Morris水迷宫法考察各组小鼠的学习与记忆能力，结果显示，与模型组相比，APP小鼠经过高、中剂量参芪五味子片治疗后，其潜伏期明显缩短，第3象限停留时间延长，穿越平台所在位置的次数增多，提示参芪五味子片可有效改善APP小鼠的学习与记忆能力，对AD症状的缓解具有重要意义。

此外，各组小鼠血清及海马体氧化应激水平检测结果显示，高、中剂量组小鼠的血清及海马体中SOD、GSH-PX及T-Aoc的水平均明显高于模型组，MDA则明显低于模型组，提示参芪五味子片可有效调节APP小鼠整体及海马体中氧化应激水平，减轻由于过氧化所导致的神经细胞损伤。

TUNEL染色能够有效反映AD小鼠海马体神经元的凋亡情况[15]。本研究结果表明，模型组及低剂量组小鼠海马体中存在较多的凋亡神经元，而高、中剂量组小鼠则仅存在少量散在的凋亡神经元，提示参芪五味子片可有效改善APP小鼠海马体神经元的凋亡情况。

本研究的局限性：首先，本文未对参芪五味子片治疗AD的具体机制进行深入探讨；其次，在对小鼠血清及海马体的氧化应激水平考察中，仅选择了部分较为典型的指标作为检测对象，而对其他的相关酶的检测并未开展，后续研究还应予以完善；最后，本研究给药剂量主要参考相关文献中推荐剂量，但该剂量是否为AD治疗中的最佳给药剂量仍需进一步探讨。

综上所述，参芪五味子片不仅可有效地改善AD小鼠的学习与记忆能力，还能够改善其氧化应激水平，值得进行深入研究。

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Effect of shenqi wuweizi tablets in the treatment of mice with Alzheimer′s diseases and its effects on the level of oxidative stress in serum and hippocampus of the mice

AI Liang

(Department of Pharmacy,Affiliated Hospital of Yan′an University,Yan′an 716000,China)

Objective To study the treatment effects of shenqi wuweizi tablets in the treatment of mice with Alzheimer′s diseases and its effects on the level of oxidative stress in serum and hippocampus of the mice.Methods The 3-month APP mice (n=50) were randomly divided into model group,positive control group,high,middle and low dose group.Ten C57BL/6 mice were selected as blank control group.The mice of high,middle and low dose groups were treated with 1.44,0.72 and 0.36 g/kg shenqi wuweizi tablets,while the donepezil was used in the positive control group.The mice of blank control group and model group were given the same amount of normal saline,feeding time for 2 months.Morris water maze experiment was performed to test the learning and memory ability of mice.After the experiment,the serum and hippocampus of each group were collected,and the levels of SOD,MDA,T-Aoc and GSH-Px were detected.The TUNEL method was used to observe the apoptosis of hippocampus of mice.Results In the water maze test,the incubation period of mice in high,middle and low dose groups were obviously shorter than that of model group.Compared with model group,the levels of SOD,T-Aoc and GSH-Px in high,middle dose groups were higher,and MDA level was lower.TUNEL staining of the mice of model and low dose group appeared more positive staining of neurons,and only a small number of apoptotic neurons were observed in high and middle dose groups.Conclusion Shenqi wuweizi tablets has good therapeutic effect on mice with Alzheimer′s disease,which can effectively improve the level of oxidative stress,and it is worth studying in depth.

Shenqi wuweizi tablets；Alzheimer′s diseases；Oxidative stress

2016-06-30

延安大学附属医院药剂科,陕西 延安 716000

10.14053/j.cnki.ppcr.201701005