百草枯中毒早期大鼠肾组织中不规则趋化因子的表达

朱 哲，王 娜，赵 敏*

·论著·

百草枯中毒早期大鼠肾组织中不规则趋化因子的表达

朱 哲1，王 娜2，赵 敏1*

目的 通过观察不规则趋化因子(Fractalkine，FKN，又称CX3CLl)在百草枯(Paraquat，PQ)中毒早期肾组织中的表达，探讨FKN在PQ致大鼠急性肾损伤中的作用。方法 SD大鼠80只，按随机数字法分为染毒组(40只)和对照组(40只)。染毒组腹腔注入PQ(22 mg/kg)，对照组给予等量生理盐水。每组分别在染毒后0.5、1、3、5 d处死大鼠。测定血清肌酐及尿素氮，HE染色观察肾组织病理改变，免疫组化法检测FKN的表达。结果 PQ染毒后大鼠出现肾功能损害，血肌酐及尿素氮同步升高，且随染毒时间延长，肾功能损害逐渐加重，与同时间对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。镜下观察，染毒组大鼠肾组织病理改变为肾小球体积增大，肾小管上皮细胞肿胀及管腔变窄；此后随观察时间延长，可见水肿渗出、坏死，间质炎性细胞浸润增加，肾小管内蛋白管型。免疫组化发现：染毒组在染毒后0.5、1、3、5 d,FKN表达呈逐渐增高趋势(P<0.05)，且明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)。结论 FKN在PQ早期大鼠肾组织中可表达，并与急性肾损伤的发病过程紧密相关。

百草枯；中毒；不规则趋化因子；肾组织

0 引言

百草枯(Paraquat，PQ)是世界范围内广泛使用的速效触杀型除草剂[1]，毒性较强且无特效解毒剂，因接触误服或自杀等原因导致的百草枯中毒病例也逐年增加。炎症反应在百草枯中毒机制中研究比较广泛[2]。不规则趋化因子(Fractalkine，FKN，又称CX3CLl)属趋化因子CX3C亚族，具有促进白细胞黏附、加快炎性因子渗出、促进炎症级联反应发生等多种生物学作用，参与了多种炎性疾病的发生及发展过程。但FKN与百草枯中毒的相关报道很少[3-6]。本实验通过观察PQ染毒早期不同时间点肾组织中FKN的表达及变化，探讨FKN与PQ致大鼠急性肾损伤的关系，为研究PQ中毒急性肾损伤的发病机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 20%百草枯溶液(江苏南通先正达药业)，兔抗大鼠CX3CLl多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 动物模型制作 SPF级健康成年雄性SD大白鼠80只(由中国医科大学附属盛京医院动物实验中心提供)，适应性喂养1周，体重(392±38)g。将80只大鼠按随机数字法分成染毒组(40只)和对照组(40只)。染毒组以PQ 22 mg/kg腹腔注射染毒，对照组给予等量的生理盐水。每组按观察时间点(染毒后0.5、1、3、5 d)随机分为4个亚组，每组10只大鼠进行试验。

1.3 标本采集 各组大鼠在建模后第0.5、1、3、5天，按照10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉。腹主动脉采血约5 mL放入离心管中，静置30 min，3 500 r/min，离心15 min，留取血浆，置于-80 ℃冰箱保存。放血处死大鼠后，留取双肾标本行病理观察及免疫组化染色。

1.4 肾组织病理学观察 肾组织用4%多聚甲醛(4 ℃，PBS配制，pH 7.4)固定，经脱水、包埋、切片、HE染色后光镜下观察肾脏病理变化(4 μm切片)。

1.5 血Cr和BUN的测定 取各组大鼠血浆，按照试剂盒说明测定血清 Cr、BUN水平。

1.6 肾组织FKN免疫组化染色 采用链霉亲和素-生物素标记法(SABC)进行染色，实验步骤严格按照试剂盒说明进行。一抗兔抗大鼠CX3CLI多克隆抗体稀释浓度为1∶50。镜下随机选取3个高倍视野，以胞质/胞膜出现棕黄色颗粒为阳性，应用免疫组化分析软件(NIS-Elements Br 3.0)进行图像分析，分别计算每个视野阳性染色的平均吸光度值(MOD)，取其平均数进行统计学处理。

2 结果

2.1 实验动物观察 对照组大鼠观察期内无明显变化，活动敏捷，饮食正常，反应正常，毛发光滑，体重增加或无明显改变。染毒组大鼠染毒0.5d后开始出现活动减少，1d后部分大鼠进食进水减少、呼吸不稳，口鼻部可见分泌物；3d及5d后大鼠出现精神萎靡、呼吸急促，严重者死亡(3d染毒组死亡3例，5d染毒组死亡5例，予同数量大鼠补充入组)。

2.2 肾组织病理变化 对照组肾小球及肾小管结构清晰，无炎性细胞浸润，小管内无管型及颗粒(图1A)。染毒组出现急性肾损伤表现。染毒后0.5d即可见肾小球体积增大，1d可见肾小管上皮细胞肿胀及管腔变窄 ，3d可见水肿渗出、坏死，间质可见炎性细胞浸润增加，5d可见肾小管内蛋白管型(见图1)。

图1 各组大鼠肾组织的病理变化(HE,×100)

2.3 染毒组和对照组不同时点血Cr和BUN比较PQ染毒后，大鼠出现肾功能损害，血肌酐及尿素氮升高(P<0.05)，且随染毒时间延长肾功能损害加重(P<0.05)，与同时间对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)，见表1。

2.4FKN在肾组织中的表达FKN在对照组中不表达或很少表达，仅见极少数肾小管细胞浆棕黄色淡染，各时间点FKN比较差异无统计学意义。染毒组在染毒后0.5、1、3、5d,FKN表达呈逐渐增高趋势(P<0.01)，且明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，见图2、图3。

3 讨论

百草枯是一种快速灭生性除草剂，具有极强的触杀作用。其对人体毒性极大，致死率高，受累的主要器官是肺脏，肾脏也是受累器官之一，且无特效解毒剂。有研究表明，针对草枯中毒患者的研究中，肾损伤的发生率高达64.9%，其中死亡患者的肾损伤发生率达到67.1%，可以看出肾损伤是影响预后的重要因素[7]。本研究成功建立PQ腹腔注射染毒大鼠动物模型，染毒后0.5 d,大鼠出现不同程度的呼吸急促，口鼻及肢端出现血性分泌物，血肌酐及尿素氮升高，HE染色见肾小球体积增大，肾小管上皮细胞肿胀、变性、空泡样变、坏死，肾小管管腔变窄，间质充血、水肿、炎性细胞浸润，提示PQ中毒早期可致肾损伤。并且实验发现，FKN在肾组织中的表达从0.5 d以后的时间点呈逐渐增加趋势，在时间上与肾组织病理损害程度相关，故认为FKN介导的炎症反应参与急性肾损伤的发生与发展过程。本研究显示，PQ中毒后0.5 d即出现肾脏组织FKN 的表达升高，且持续较长时间，提示FKN可能参与了肾脏早期炎性损害及功能衰竭的发生。通过以上实验推测，FKN参与的炎症反应，也是PQ中毒者多脏器功能障碍或死亡的一个重要因素。

表1 各组大鼠不同时点肾功能的变化

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

图2 各组大鼠肾组织FKN免疫组化染色结果(SABC，×400)

图3 各组大鼠肾组织FKN比较

FKN是趋化因子CX3C亚族的唯一成员[8-9]，主要表达在内皮细胞及上皮细胞，是活化的内皮细胞分泌的具有黏附功能的趋化因子，具有膜结合型和可溶型两种形式。膜结合型FKN可对白细胞上FKN受体CX3CR1起黏附作用，并支持整合素非依赖性白细胞黏连。当膜结合型FKN被溶蛋白性裂解后以游离的形式释放，趋化多种炎性细胞，促进炎症级联反应的发生。FKN是与多种细胞因子相关联的活性因子。有研究表明，FKN与CX3CRl结合以后，可以增加NF-κB、TGF-β1的表达，从而产生相应的生物学效应[10]。已有实验证明NF-κB及TGF-β1在PQ中毒中都发挥着重要作用[11-16]，FKN在百草枯中毒肾组织中的表达可能成为PQ中毒的新靶点。

本实验证实了FKN同PQ中毒肾损伤程度的相关性，但与PQ中毒相关研究仍需更多实验证实。FKN兼具趋化和黏附双重功能，其受体CX3CRl的特异性在百草枯中毒的临床治疗实践中的应用值得深入探索。

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Expression of the Fractalkine in kidney tissue of SD rats with early paraquat poisoning

ZHU Zhe1，WANG Na2，ZHAO Min1*

(1.Department of Emergency，Shengiing Hospital of China Medical University，Shenyang 110004，China;2.Liaoning Province Hospital for Occupational Disease Prevention and Treatment,Shenyang 110005,China)

Objective To investigate the effect of fractalkine (FKN) on acute renal injury induced by paraquat poisoning in rats by observing the expression of FKN in renal tissue.Methods A total of 80 SD rats were randomly divided into two groups: PQ group (n=40) and control group (n=40).PQ 22 mg/kg and an equal volume of normal saline were administered intraperitoneally in PQ group and control group.Rats were separately sacrificed at 0.5,1,3 and 5 d after poisoning.The serum creatinine (Cr),urea nitrogen (BUN) and the pathological changes of the renal tissue were measured by HE staining.The FKN expression was observed by immunohistochemistry method.Results After PQ poisoning,the renal failure appeared in the rats of PQ group,and the Cr and BUN increased at the same time.As poisoned time prolonged,the Cr and BUN increased more significantly,and there were significant differences in Cr and BUN between the two groups (P<0.05).The pathological changes of renal tissue in rats of PQ group,including increased glomerular volume,the swelling of tubular epithelial cells and the narrowing of the lumen were observed under the microscope.Then the edema exudation,necrosis,increased infiltration of inflammatory cells and visible protein tube in renal tubules appeared as the observation time prolonged.The results of HE staining showed that the FKN expression of rats in PQ group at 0.5,1,3 and 5 d after being poisoned increased gradually (P<0.05),and there were significant differences between the two groups (P<0.01).Conclusion FKN can be expressed in renal tissue of early PQ rats,which is closely related to the pathogenesis of acute kidney injury.

Paraquat;Poisoning;FKN;Renal tissue

2016-10-20

1.中国医科大学附属盛京医院急诊科，沈阳 110004;

2.辽宁省职业病防治院，沈阳 110005

国家重点专科建设项目(卫办医政函[2012]649号)

10.14053/j.cnki.ppcr.201701001

*通信作者