野生动物结核病检测技术研究进展

植广林 平晓坤 陈绚姣 赵 琰 梁玉珍 黄 勉 贾 坤*

(1.广州动物园，广州，510070；2.华南农业大学兽医学院，广州，510642；3.广东省兽医临床重大疾病综合防控重点实验室，广州，510642)

野生动物结核病检测技术研究进展

植广林1平晓坤2，3陈绚姣1赵 琰2，3梁玉珍1黄 勉1贾 坤2，3*

(1.广州动物园，广州，510070；2.华南农业大学兽医学院，广州，510642；3.广东省兽医临床重大疾病综合防控重点实验室，广州，510642)

稿件运行过程

野生动物； 结核病； 分枝杆菌； 检测方法

现今国内外关于野生动物结核病的检测方法大致上可归为3类：第一类是细菌学检测，如涂片镜检、细菌培养、动物实验等；第二类为免疫学检测，常见的有皮内变态反应等；第三类是分子生物学诊断技术，常见的有PCR、核酸探针技术、LAMP等检测技术。

中国城市化的进程让更多的人进入城市，人们接触野生动物的机会更多是在动物园里，这使得一旦在动物群体中爆发结核病，如果不能及时检测出来，就有可能爆发大规模的感染。对于结核病的危害在集约化养殖的牧场中每年都会产生巨额的损失，野生动物带菌状况更是无法精确统计，所产生的损失和危害无法估计[1]。野生动物活动范围广，对人类的警惕性也更强，且具有一定的攻击性，现行的检测方法有着其本身的实际使用优势，但同时由于检测方法本身的限制，例如野生动物区别于集约化养殖动物，难以保定，采样困难等，传统的检测技术在实际检测过程中有一定难度。传统的检测手段以及现行的先进的实验室检测方法虽然都有着各种的限制条件及其本身的不足，但对于建立新的检测方法具有重要的借鉴意义，同时提供了理论基础。因此准确了解各种检测方法的优缺点是很有必要的，本文就现行的对于动物结核病的检测方法作一简单的综述，望能为新的检测方法提供帮助。

1 细菌学检测

1.1 抗酸染色法

由于分枝杆菌(Mycobacteriumspp.)的细胞壁内含有大量的脂质包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，经过加热和延长染色时间可使其固定着色。在分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就可以不被酸性脱色剂脱色而呈现出肉眼可见的红色，从而达到对病料进行染色的目的[2]。在普通光学显微镜油镜下可检出抗酸性杆菌。抗酸染色方法常用萋尼二氏染色法，也可用荧光抗酸染色法。如果镜检组织内有抗酸性染色的微生物，并且动物组织具有典型的组织学病变，就可以做出初步诊断。虽然抗酸染色法阳性检出率比较低，但它作为一种传统的检测方法，具有假阳性率低、成本低廉、操作简便快捷等特点[3]。在对于圈养野生动物的检测上，笔者通过对疑似结核病感染动物进行采样之后，进行涂片观察，就可快速做出初步判断，不需要其他复杂的检测手段，此法在野生珍稀动物的结核病快速检测和及时治疗上尤为重要，所以该方法在实际应用中具有一定的实用价值。缺点是对于致病性分枝杆菌和非致病性分枝杆菌难以区分，对于菌株的种属特异性也难以进行区分。

1.2 细菌分离培养法

细菌分离培养常用选择性培养如罗氏培养基，改良罗氏培养基用来分离分枝杆菌，再通过培养所得菌落性状和生化试验来鉴定，也可结合核酸探针和聚合酶链式反应(PCR)方法进行鉴定，同时上述抗酸染色同样可适用于分离培养后的细菌鉴定，本研究目前也建立了结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的PCR检测技术，在对临床样品的检测中发挥了重要的作用。但如果存在培养物污染或其他的特殊原因，也可通过接种豚鼠，再通过分离鉴定来检出病原菌。不足之处是在上述培养基中，结核分枝杆菌需经过14～15 h才能分裂扩增一次，这使得整个病原学检测所需时间较长，一般需10～30 d才能在培养基看到较为清楚的菌落[2]，对于病原菌的检出阳性率也较低。且在细菌分离培养过程中，出于公共卫生安全以及对实验人员的保护，一般都需要在生物安全柜中进行接种菌株操作，且需要专业人员在生物安全三级实验室中进行培养细菌。该检测方法所需的较长的检测时间对于快速检出病原菌的需要存在着先天条件上的不足。由于该方法在检测时效性以及所需的较高的实验条件等种种原因的限制，在对于野生动物结核病的检测上有多种不足，所以在实际工作中很少被采用。

2 免疫学检测

这类方法的原理主要是通过检测特异性的抗原抗体免疫反应。通过检测抗原特异性的T淋巴细胞在体外接受相应抗原刺激活化后分泌的T淋巴细胞活化标记分子，可以判断机体对某种病原的致敏情况，从而间接反映是否被该病原感染。它是一种快速、简便的检查技术，并且在多种疾病的诊断中得到广泛应用。目前，报道研究最多的免疫学诊断技术主要有γ-干扰素(IFN-γ)诊断法、ELISA(酶联免疫吸附剂测定)法，ELISPOT(酶联免疫斑点检测)法，白细胞介素诊断法等。与PPD皮内试验相比，上述具有出现反应早相比于PPD皮内试验所需要的20 d以上的要求，利用类似于γ-干扰素诊断等方法在动物被感染后2～3周即可得到阳性结果，具有快速、灵敏的优点。

2.1 结核菌素(PPD)皮内试验

结核菌素皮内反应属于迟发型细胞过敏反应。结核菌或卡介苗进入机体使机体的免疫T淋巴细胞致敏，并在机体内大量分化增殖。当已致敏的机体再次遭受到抗原入侵时，已致敏的淋巴细胞就会与之结合，引起机体被注射部位出现硬块甚至发生水泡、坏死等变态反应性炎症。通过对动物注射结核菌素后所出现的一系列炎症反应来判断机体是否感染结核杆菌。

通过接种结核菌素一方面可以检测机体是否感染分枝杆菌。另一方面，通过结核菌素试验可以判断接种卡介苗是否接种成功。此方法在长期的生产实践中被证明是检测动物结核病的可靠的筛选试验，在实际的生产生活中被广泛采用。但该方法的不足之处在于，对因感染其他非致病性分枝杆菌而致敏的动物检测结果同样呈阳性，无法通过所出现的免疫反应来判断为何种致病菌，且在那些因病情严重而导致免疫反应低下的动物易出现假阴性。此外，结核菌素皮内试验需要消耗大量人力，检验周期较长，所以有一定的滞后性。由于DTH(迟发型变态反应)的滞后效应，此方法不能在30 d内重复进行。在对已经进行BCG(卡介苗)免疫的动物群体，由于BCG疫苗中含有与PPD相同的抗原成分，因而PPD皮内试验不能鉴别免疫动物与感染动物[4]。同时对于野生动物来说，野生动物的不稳定性对动物的保定、注射结核菌素以及后期的对注射部位的观测以确定是否有分枝杆菌感染都是需要顾及到的因素，PPD的质量和剂量，结果判定标准及操作方法等因素均能影响检测结果，故需严格进行质量控制。在一些国家，使用比较结核菌素试验，即比较皮内试验(SICTT)，在动物颈部一侧的不同部位，同时注射两种PPD，根据出现的不同反应，能够提示被检动物是结核杆菌感染还是非特异的DTH反应[4]。

2.2 γ-干扰素(IFN-γ)检测

该检测方法由Wood等人于1990年建立，其原理为致敏的外周血淋巴细胞在体外培养的条件下，接受特异抗原(如PPD)刺激后被活化，表达并分泌IFN-γ，通过一定的技术手段对培养上清中的IFN-γ进行检测(如ELISA)，或者对IFN-γ mRNA的表达进行定量或者半定量(如RT-PCR)检测，还可通过ELISPOT技术对分泌IFN-γ的淋巴细胞进行计数(形成的斑点数)及对单个细胞分泌的IFN-γ进行定量(形成的斑点大小)检测，其结果与淋巴细胞增生试验具有很好的相关性[5]。具体操作，将1mL的肝素抗凝血液和PPD在37℃培养过夜，第二天收集血浆样品并以夹心ELISA检测IFN-γ[6]。用作全血培养刺激物的抗原是Mycobacteriumbovis的PPD和Mycobacteriumavium的PPD(后者用于检查交叉反应)。该测定系统简便、快速，便于用作疫情监测时大量样品的测试。与皮内变态反应相比，该方法减少了操作中的主观性，其敏感性和特异性更高，在皮内试验进行后再进行IFN-γ试验，其灵敏度和特异性未有显著影响(分别为85%和93%)，因此可以作为皮内试验理想的补充试验[7]。γ-干扰素释放对淋巴细胞转化试验的主要技术障碍是在采血后需尽快处理血液样品，且实验费用高昂，限制了该方法从研究到临床的实际应用。

2.3 白细胞介素检测

感染分枝杆菌后的机体多呈现以细胞免疫为主的免疫反应，IL-2主要由刺激活化后的T淋巴细胞分泌，可以作为T淋巴细胞介导的免疫反应的指标。由于IL-2具有刺激成淋巴细胞增生的特性，通过测定牛外周血淋巴细胞(PBL)经抗原刺激培养后的上清中IL-2的生物活性，以重组人IL-2建立的标准曲线作对照，可以IL-2活性进行半定量测定。以此来检测机体是否感染结核分枝杆菌。结核分枝杆菌能够通过刺激机体单核巨噬细胞来合成并释放IL-6[8]。结核分枝杆菌的内毒素脂多糖(LPS)可刺激单核细胞释放IL-6增多[9]。IL-6的水平与结核病的感染有重要关系，是结核病诊断的潜在标志物，IL-6水平检测可辅助诊断结核病。对于IL-6的检测常用方法如ELISA法，放射免疫检测法，酶联免疫斑点法等方法[10]。IL-6的最低检测量可达3pg/mL[11]，灵敏度较高。联合IL-2，IL-6，IFN-γ不但可以更加准确的检测出机体感染分枝杆菌的情况，而且还可以在检测活动性结核病与潜伏性结核感染鉴别诊断中提供有力依据[12]。

2.4 ELISA检测技术

ELISA技术是利用抗原抗体专一性键结合的特性进行抗原或抗体检测。在多种动物疾病诊断中发挥着重要作用，近年来深受动物疫病筛查工作者的喜爱。结核分枝杆菌感染后由于细胞免疫起决定作用，因此对于结核杆菌感染后所产生的血清抗体有限，如何发现这些抗体并建立有效的ELISA检测技术，给科研工作者带来了挑战，目前本项目筛选了多个基因片段，开展ELISA检测技术的研究，以期获得特异性好、灵敏度高的ELISA检测技术来提高结核病的检出率。

3 分子生物学诊断

3.1 聚合酶链反应(PCR)技术

PCR技术在生命科学领域经过数年的努力积累了大量的资料和经验，使这一方法不断完善，其反应灵敏、特异、快速的特性在多数报告中得到肯定[13]。该检测方法首先要选择合适的DNA片段，其次引物设计要符合一定的原则，这直接关系到临床样本检测的敏感性和特异性，通过对不同的特异区段设计相应引物，能够鉴别各种分枝杆菌。再者要注意结核杆菌DNA的处理。结核杆菌的细胞壁具有特殊性，能否有效的破裂其细胞壁而使DNA释放，是提高临床样品中结核杆菌检出率的关键，可以采用经典法、煮沸法、超声粉碎法等。PCR自20世纪80年代问世以来，被大量用于结核病实验室研究及临床诊断，但由于很多问题如易污染、假阳性高、使用致癌物(溴化乙啶)、操作繁琐等曾一度被质疑，为此研究人员正在不断开发出新的高灵敏度和高特异性的PCR方法，如反转录PCR法、套式PCR法、单管套式反转录PCR法、实时荧光PCR、酶联PCR等[14-15]，本实验室根据不同类型分枝杆菌的特异片段，建立了结核分支杆菌的PCR分类鉴定技术，在对临床病例的检测中，能够准确区分结核分支杆菌、牛分支杆菌及非结核分枝杆菌。

由于PCR方法检测的是核酸，故一般PCR方法无法鉴定死菌和活菌，不能区别活动型和静止型结核病，更不能给临床治疗提供有效的监测手段。反转录PCR虽然能检测活菌，但其对样本处理要求较高而目前仍难以在临床上推广应用。综上所述，PCR方法在结核病分子诊断中己展现了巨大的应用价值。但临床实验室必须在充分了解PCR测定具有不确定性基础上，采取相应质控措施，才能确保试验结果的准确性，而不致出现重大判断失误。因为PCR扩增可得到极大的检测灵敏度，但同时其对检测中的错误也有极大的放大作用。因此，对于PCR检测结果的报告必须慎重。必须有相应严格质量控制措施，如内质控、阴性和阳性质控的情况下重复测定，才可报告检测结果，并对检测做出实事求是的解释[16]。

3.2 核酸探针技术

PCR-荧光探针技术是采用双重PCR技术和Taqman探针技术相结合，通过在临床患病动物的痰标本中提取分枝杆菌核酸进行定性检测，分别针对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的特异性序列设计引物和探针，探针分别标记不同的荧光发光基团，通过监测不同荧光通道的荧光信号变化，检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌感染，该技术具有特异性强、灵敏度高、简便易行等优点[17]。应用PCR-荧光探针法在临床标本中进行大样本快速检测和鉴别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，这一点对于群居性动物的结核病快速检测具有很高的应用价值，目前国内的博奥生物有限公司生产的分枝杆菌核酸检测试剂盒可以快速检测和区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，1 d可以完成诊断检测，国内已经有研究报道这一技术[18]，这一技术对于快速分检出结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，为临床治疗提供了有力的帮助。

4 小结

综上所述，现行的对于结核病原菌的检测方法都有着自己本身的优缺点，细菌分离培养方法虽然实验方法简单且可以准确进行结核病的诊断及病原的分析，但是由于在传统培养基培养结核杆菌方法中对于培养过程中的实验条件要求过高，出于生物安全方面的考虑所需要的条件并不适合于野生动物的结核病菌检测，且培养过程中结核杆菌生长缓慢，不利于对疑似感染动物进行快速处置及采取相应防控措施，随着科研方面的发展近年来出现了一系列的快速培养系统，这些快培系统的共同点是均使用液体培养基，培养过程中细菌生长于一个相对密闭安全的环境中，在这些培养基中由于培养基内所添加的营养物质，分枝杆菌在培养基中初代分离率高于L-J法，得到检测结果所需要的时间也少于L-J法[15]，随着培养方法的进步，结合PCR技术极大的检测灵敏度，两者结合会是一个适合快速准确判断机体是否感染结核杆菌的检测方法。

现行的免疫学检测虽然简单易行，但由于目前试剂昂贵，导致大规模实施的成本过高，落实推广尚有待时日。分子生物学检测方面，目前应用ELISPOT方法检测细胞因子(尤其是IFN-γ)，PCR检测技术特别是核酸探针技术已经在医学领域得到了广泛应用。这些先进的检测技术具有传统检测方法所不具有的快速性、准确性。经过改良过后在野生动物结核病检测上将具有广阔的应用前景。因此，将现行的医学领域已经成熟的检测方法进行改良将会成为野生动物结核病检测的研究热点。

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Wild animal； Tuberculosis； Mycobacteria； Testing

结核病(Tuberculosis，TB)是一种人兽共患的慢性消耗性传染病，该病感染宿主广泛，可以交互传染，很难根绝。近年来野外和圈养野生动物的结核病疫情呈现增高的趋势，不但造成重大经济损失，而且影响到公共卫生安全。野生动物的结核病主要是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)和牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)所引发，其感染宿主谱很广，并具有或潜在具有传播给人类的能力。因此，建立快速准确的结核病检测方法意义重大。现在较为广泛使用的结核病检测方法主要分为3大类，分别是细菌学检测、免疫学检测以及分子生物学诊断，但是这些检测方法仍存在许多问题。目前对于野生动物结核病检测迫切需要新的快速、灵敏、特异的动物结核病诊断方法。本文就现行的检测技术研究进展作一简要概括。

The Progress in Testing Technology ofTuberculosis in Wild Animal

Zhi Guanglin1Ping Xiaokun2，3Chen Xuanjiao1Zhao Yan2，3Liang Yuzhen1Huang Mian1Jia Kun2，3*

(1.Guangzhou Zoo，Guangzhou，510070，China；2.College of Veterinary Medicine，South China Agriculture University，Guangzhou，510642，China；3.Guangdong Provincial Key Laboratory of Prevention and Control for Server Clinical Animal Diseases，Guangzhou，510642，China)

Tuberculosis(TB)is a progressive wasting disease which is a zoonosis.In recent years，the frequency of TB epidemics in wild and captive wildlife has been increasing due to the infection ofMycobacteriumtuberculosisandMycobacteriumbovis.This disease has caused enormous economic loss and affects human public health over the long-term because of the potential risks of the transmission of the disease to humans.The rapid and accurate detection of TB is important.Based on our literature review，contemporary TB testing technologies include microbiological detection，immunological assay，and molecular biological diagnosis.However，because there are still some problems with these methods，new rapid，sensitive and specific animal TB diagnosis methods are needed.This paper briefly summarizes the progress of TB diagnosis and quarantine technologies.

植广林，男，37岁，硕士，兽医师；从事野生动物疾病研究。E-mail：zhiguanglin@163.com

*通讯作者：贾坤，E-mail：jiakun@scau.edu.cn

2016-08-15

S855.2 S858.9

A

修回日期：2016-08-29

发表日期：2017-02-10

2310-1490(2017)01-148-05