细胞穿透肽VP22对抑癌蛋白PTEN体外抗肿瘤作用影响的研究*

李婷婷，杨 勤，余 娴，何冠军，雷 军△

(1.川北医学院麻醉学系，四川南充 637000；2.川北医学院附属医院感染科，四川南充 637000；3.重庆医科大学附属第二医院药学部，重庆 400010；4.川北医学院药学院，四川南充 637000)

论著·基础研究

细胞穿透肽VP22对抑癌蛋白PTEN体外抗肿瘤作用影响的研究*

李婷婷1，杨 勤2，余 娴3，何冠军4，雷 军4△

(1.川北医学院麻醉学系，四川南充 637000；2.川北医学院附属医院感染科，四川南充 637000；3.重庆医科大学附属第二医院药学部，重庆 400010；4.川北医学院药学院，四川南充 637000)

目的 构建表达细胞穿透肽融合蛋白第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)-VP22的真核表达质粒，在食管癌细胞Eca109细胞中验证细胞穿透肽VP22能否增强抑癌蛋白PTEN体外抗肿瘤作用。方法 通过本实验室前期构建成功的重组真核表达质粒pcDNA3-PTEN、pcDNA3-PTEN-VP22和pcDNA3-VP22，转染至Eca109细胞，以pcDNA3空质粒转染作为阴性对照，细胞免疫荧光法检测各组PTEN蛋白表达情况，Western blot法检测各组PTEN蛋白和免抗磷酸化-Akt(p-Akt)蛋白的表达水平，CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞术测细胞凋亡率。结果 与pcDNA3相比，pcDNA3-PTEN、pcDNA3-PTEN-VP22都能抑制Eca109细胞增殖(P<0.05)，促进Eca109细胞凋亡(P<0.05)；pcDNA3-PTEN-VP22抗肿瘤活性显著高于pcDNA3-PTEN(P<0.05)，pcDNA3-PTEN-VP22的p-Akt表达显著低于pcDNA3-PTEN(P<0.05)。结论 细胞穿透肽VP22能增强抑癌蛋白PTEN对Eca109细胞体外抗肿瘤活性，其机制可能与其下调p-Akt表达水平有关。

食管肿瘤；肿瘤蛋白质类；重组融合蛋白质类；转染；肽类；PTEN；VP22；基因治疗

食管癌是全球常见的十大恶性肿瘤之一，我国食管癌发病率、病死率高居榜首[1-2]。研究发现第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN)表达下调与食管癌细胞分化程度、浸润深度及淋巴结转移密切相关[3-5]，但基因转导效率低阻碍了肿瘤基因治疗的应用。1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)间层蛋白VP22是一种高效的细胞穿透肽，研究已经报道了VP22能介导抑癌蛋白P27、P53在细胞间转运，并显示出对多种肿瘤细胞显著的抗肿瘤活性[6-7]。本研究通过构建PTEN/VP22融合蛋白真核表达质粒，验证VP22能否增强PTEN的转运和表达，为研究体内治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 真核表达质粒pcDNA3由本实验室保存，购自美国Invitrogen公司；pcDNA3-PTEN、pcDNA3-PTEN-VP22、pcDNA3-VP22由本实验室构建并保存[8]；人食管癌细胞Eca109由川北医学院分子生物学研究所惠赠；Lipofectamine 2000脂质体购自美国invitrogen公司；兔抗PTEN单克隆抗体购自美国abcam公司；兔抗磷酸化-Akt((p-Akt)单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG、HRP标记羊抗小鼠IgG、鼠抗β-actin购自Beyotime公司；异硫氰酸荧光素(FITC)-羊抗兔IgG购自武汉博士德公司；二氨基联苯胺(DAB)辣根过氧化物酶显示试剂盒、CCK-8试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)凝胶配置试剂盒购自Beyotime公司；细胞凋亡Annexin V/碘化丙啶(PI)试剂盒购自联科生物。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将Eca109细胞培养在含10%热灭活的胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，在37 ℃、含5%CO2的孵箱中孵育。

1.2.2 试验分组和细胞转染 (1)试验分为4组，PTEN组、PTEN-VP22组、试验组(VP22组)，对照组(pcDNA3组)。(2)细胞转染：取对数生长期的Eca109细胞接种于相应的培养板中，待细胞长至50%～70%融合时更换无血清培养基，按lipofectamine2000说明书步骤进行转染，同时用荧光标记的质粒pEGFP-N1转染目的细胞，在荧光显微镜下观察转染效率。

1.2.3 细胞免疫荧光检测PTEN蛋白的表达 待24孔板中细胞长至50%～70%融合时按每孔转染0.5 μg DNA，48 h后用含多聚甲醛免疫染色固定液固定10 min，含Triton X-100免疫染色洗涤液透化5 min，共两次，rabbit anti-PTEN(1∶100) 一抗4 ℃过夜封闭，次日加入FITC标记的羊抗兔IgG(1∶50稀释)，37 ℃孵育1 h，荧光显微镜下观察PTEN蛋白的表达，并用荧光酶标仪检查荧光光密度(OD)值。

1.2.4 Western blot检测PTEN蛋白和p-Akt蛋白的表达 待25 cm2细胞培养瓶中细胞生长至50%～70%融合时按上述方法每瓶转染10 μg DNA，48 h后用预冷刮刀刮取细胞至EP管中离心，加入50 μL裂解液(1 mmol/L PMSF) 4 ℃持续振摇裂解30 min后离心，上清液即为所提蛋白。按照碧云天二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒步骤测定蛋白浓度，与5×蛋白上样缓冲液按照5∶1的比例混匀，沸水中加热5 min充分变性，进行10%SDS-PAGE分离后转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，Western封闭液1 h，一抗4 ℃摇床过夜孵育，二抗室温孵育1 h，DAB显色，用Image-labe软件读取各组条带灰度值。

1.2.5 CCK-8法细胞增殖活性检测 取对数生长期细胞，以每孔1×104/100 μL接种到96孔板，当细胞生长至50%融合时，分别用4组质粒转染，设置5个浓度梯度，即1、2、3、4、5 μg/mL，每组每个浓度设置3个复孔，分别培养24、48、72 h后按CCK-8试剂说明书进行OD值的检测。

1.2.6 流式细胞术测细胞凋亡率 待6孔板中的细胞长至50%～70%融合时每孔转染2.5 μg DNA，48 h后加入不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶(0.25%)消化，1 200 r/min离心5 min收集1×105/管细胞沉淀，500 μL 1×binding buffer重悬细胞，加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，室温暗室孵育5 min，400目筛网过滤后，用流式细胞仪进行检测，Winmdi软件分析细胞凋亡率。

2 结 果

2.1 细胞免疫荧光检测PTEN蛋白和PTEN-VP22融合蛋白的表达情况 分别用4组质粒转染Ec109细胞48 h后，细胞免疫荧光检测发现PTEN组和PTEN-VP22组可见发绿色荧光细胞，PTEN-VP22组绿色荧光蛋白的量明显多于PTEN组，pcDNA3组和VP22组未见发绿色荧光的细胞(图1)。通过荧光定量酶标仪对各组绿色荧光蛋白的OD值进行测量，发现PTEN组和PTEN-VP22组OD值明显高于pcDNA3组(P<0.05)，PTEN-VP22组OD值明显高于PTEN组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

A:PTEN组；B:PTEN-VP22组；C:pcDNA3组；D:VP22组。

图1 细胞免疫荧光检测PTEN蛋白在不同质粒转染组的表达情况(×20)

*：P<0.05，与pcDNA3组比较；#：P<0.05，与PTEN组比较。

图2 各转染组PTEN荧光蛋白定量OD值

2.2 Western blot检测目的蛋白的表达情况 Western blot 结果显示PTEN和PTEN-VP22组分别检测到相对分子质量为54×103的PTEN蛋白和相对分子质量为90×103的PTEN-VP22融合蛋白的特异性条带(图3)。和pcDNA3组相比，PTEN组和PTEN-VP22组p-Akt蛋白的表达减少(P<0.05)，PTEN-VP22组p-Akt蛋白灰度值低于PTEN组(P<0.05)，差异具有统计学意义，见图4、5。

1:PTEN组；2:PTEN-VP22组；3:pcDNA3组；4:VP22组。

图3 Western blot检测各转染组PTEN、PTEN-VP22蛋白表达情况

1:pcDNA3组；2：PTEN组；3:PTEN-VP22组；4:VP22组。

图4 Western blot 检测 p-Akt蛋白在各转染组中的表达水平

*：P<0.05，与pcDNA3组比较；#：P<0.05，与PTEN组比较。

图5 Western blot分析p-Akt蛋白在不同质粒转染组中表达水平

2.3 CCK-8检测4组质粒对Eca109细胞增殖活性的影响 与pcDNA3组相比，PTEN-VP22组和PTEN组Eca109生长呈现抑制作用(P<0.05)，其抑制作用具有时间、浓度依赖性，PTEN-VP22组在0.5 μg/mL处开始，较PTEN组出现显著地抑制细胞增殖的活性(P<0.05)，作用48 h后在0.5 μg/mL浓度处其抑制率接近50%，而VP22对Eca109的生长未表现出抑制作用(P>0.05)，见图6。

A:作用48 h时不同浓度药物对细胞的生长抑制曲线；B:0.5 μg/mL药物作用不同时间对细胞的生长抑制曲线。

图6 CCK-8检测各组细胞增殖活性

2.4 Annexin V/PI双染法检测4组质粒对Eca109细胞凋亡的影响 PTEN组、PTEN-VP22组、VP22组细胞凋亡率分别为(30.66±0.99)、(69.55±0.38)%和(7.86±0.13)%，pcDNA3组凋亡率为(7.65±0.28)%。和pcDNA3组相比，PTEN组、PTEN-VP22组凋亡率明显升高(P<0.05)，并且PTEN-VP22组凋亡率也明显高于PTEN组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图7、8。

A:PTEN组；B:PTEN-VP22组；C:pcDNA3组；D:VP22。

图7 流式细胞仪检测各组细胞凋亡

*：P<0.05，与pcDNA3组比较；#：P<0.05，与PTEN组比较。

图8 流式细胞仪检测各组细胞凋亡

3 讨 论

PTEN基因定位于人类染色体10q23.3，全长200 kb，有9个外显子和8个内含子，编码的PTEN蛋白含有403个氨基酸。PTEN的基因产物是一种多功能蛋白，具有脂质磷酸酶活性，可对抗磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K)调控的细胞生长因子信号转导通路，降低脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate,PIP3)水平，抑制肿瘤细胞的增殖、促进凋亡[8-9]。根据PTEN基因及其表达产物结构和PTEN在其他肿瘤表达下调机制的研究，发现PTEN基因遗传学及表观遗传学异常导致食管癌中PTEN表达减少[10]。本研究通过外源性导入表达PTEN蛋白的重组质粒，结果发现PTEN重组质粒能在Eca109细胞中表达PTEN蛋白，发挥抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡的作用，这与李菲[11]研究的转染 PTEN 质粒对食管癌细胞增殖具有一定的抑制作用的报道一致。

研究已经证实，VP22融合蛋白能够介导治疗蛋白在相邻的细胞间进行转运，从而达到治疗性蛋白发挥功效的水平，在整体上发挥生物学效应。本研究将重组质粒pcDNA3-PTEN、pcDNA3-PTEN-VP22用脂质体介导的基因转染方法转入细胞后进行免疫荧光实验，结果发现PTEN-VP22组PTEN绿色荧光蛋白的表达量明显高于PTEN组，说明VP22确实能够介导PTEN蛋白在细胞间转运，增加PTEN蛋白的表达和分布，VP22介导蛋白的转运机制大体是通过高尔基体依赖的途径将其蛋白从最初转染的细胞分泌，并且非常高效地转运至邻近的细胞[12]。同时，本研究观察到PTEN/VP22蛋白主要在细胞质表达，细胞核也有少量的表达，这和PTEN蛋白的表达一致，所以VP22并不改变PTEN蛋白在细胞中的定位，这就决定了PTEN和其他只在细胞核发挥作用的肿瘤抑制基因不一样，PTEN在调节细胞质和细胞核的功能上都发挥着重要作用[13]。

大量研究发现PTEN的基因产物是一种具有蛋白和脂类双重磷酸酶活性的抑癌蛋白，并且大多数肿瘤相关PTEN基因的突变都聚集在磷酸酶结构域，提示PTEN磷酸酶活性在控制肿瘤的发生中起着重要的作用。PTEN蛋白能够使局部黏著斑激酶(FAK)、Shc信号分子去磷酸化，FAK是调节细胞与细胞间黏附的关键分子，Shc与细胞的扩散和迁移调控有关。PTEN的脂质磷酸酶活性在调控PI3K细胞增殖信号通路中发挥着重要作用，同时PTEN也能抑制PI3K下游目标丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt/PKB)活性，此活性被认为是PTEN抗肿瘤作用的关键[14]。研究还发现PTEN过表达会减少Akt信号通路的激活，使其下游作用分子p-Akt表达量下降[15]。本试验发现PTEN-VP22和PTEN组中p-Akt蛋白的量低于阴性对照组和空白对照组，PTEN-VP22组蛋白水平又低于PTEN组，说明抑癌蛋白PTEN确实能减少p-Akt蛋白表达水平，同时VP22能增强PTEN-VP22融合蛋白表达，并且保留PTEN蛋白的生物学活性，即负性调控PI3K/Akt信号通路，降低Akt的磷酸化水平，从而发挥抑癌活性。

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Research on influence of cell penetrating peptides VP22 on in vitro anti-tumor effect of tumor suppressor protein PTEN*

LiTingting1,YangQin2,YuXian3,HeGuanjun4,LeiJun4△

(1.DepartmentofAnesthesiology,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China;2.DepartmentofInfectiousDisease,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China;3.DepartmentofPharmacy,SecondAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China;4.CollegeofPharmacy,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China)

Objective To construct the eukaryotic expression plasmid of cell penetrating peptides fusion protein PTEN-VP22 and to verify whether cell penetrating peptides VP22 could enhance the in vitro anti-tumor effect of tumor suppressor protein PTEN in esophageal cancer Eca109 cells.Methods The recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3-PTEN,pcDNA3-PTEN-VP22 and pcDNA3-VP22 constructed by our laboratory at earlier stage were transfected into Eca109 cells respectively,and the cells transfected with empty plasmid pcDNA3 were used as negative control group.Immunofluorescence was used to detected the expression of PTEN protein in each group and PTEN-VP22 fusion protein,Western blot were used to determine the expression levels of PTEN and p-Akt protein,the cell proliferation activities were measured by CCK-8 method and the cell apoptosis rate was analyzed by flow cytometry.Results Compared with the pcDNA3 control group,the pcDNA3-PTEN group and pcDNA3-PTEN-VP22 group both inhibited the proliferation of Eca109 cells(P<0.05) and promoted the apoptosis of Eca109 cells(P<0.05) and the anti-tumor activities in pcDNA3-PTEN-VP22 group was significantly higher than that in the pcDNA3-PTEN group(P<0.05).The expression level of p-Akt in the pcDNA3-PTEN-VP22 group was significantly lower than that in the pcDNA3-PTEN group(P<0.05).Conclusion The cell penetrating peptides VP22 can enhance the anti-tumor activity in vitro of PTEN protein to Eca109 cells,its mechanism may be associated with the down-regulation of p-Akt expression level.

esophageal neoplasms;neoplasm proteins；recombinant fusion proteins；transfection；peptides;PTEN;VP22;gene therapy

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.03.007

四川省科技厅资助项目(2009JY0122)。 作者简介：李婷婷(1990-)，助教，硕士，主要从事生物技术药物药理学方面研究。△

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1671-8348(2017)03-0308-04

2016-07-13

2016-10-04)