Nrf2/ARE通路与PI3K/AKT通路相互作用对胰岛细胞半胱天冬酶-3表达的影响*

李 程，夏纪毅，万 沁

(1.西南医科大学附属医院内分泌科，四川泸州 646000；2.重庆市荣昌区人民医院内分泌科 402460；3.西南医科大学药物与功能性食品研究中心，四川泸州 646000)

论著·基础研究

Nrf2/ARE通路与PI3K/AKT通路相互作用对胰岛细胞半胱天冬酶-3表达的影响*

李 程1,2，夏纪毅3，万 沁1△

(1.西南医科大学附属医院内分泌科，四川泸州 646000；2.重庆市荣昌区人民医院内分泌科 402460；3.西南医科大学药物与功能性食品研究中心，四川泸州 646000)

目的 探讨核因子相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)通路与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路相互作用对2型糖尿病(T2DM)大鼠胰岛细胞凋亡和半胱天冬酶-3(Caspase-3)蛋白表达的影响及其可能机制。方法 将60只雄性Wistar大鼠分为正常对照组(NC组，n=20)、糖尿病模型组(DM组，n=20)和叔丁基对苯二酚干预组(tBHQ组，n=20)，干预8周后处死所有大鼠，TUNEL检测胰岛细胞凋亡，酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清及胰腺组织中丙二醛(MDA)水平，Western blot检测AKT、p-AKT、总Nrf2、核Nrf2、血红素氧合酶1(HO-1)、Caspase-3在胰岛细胞中蛋白表达水平。结果 与NC组比较，DM组胰岛细胞凋亡率显著增加(P=0.000)，而tBHQ组胰岛细胞凋亡率明显低于DM组(P=0.000)。DM组血清及胰腺组织中MDA水平较NC组明显升高(P=0.000)，而tBHQ组血清及胰腺组织中MDA水平明显低于DM组(P=0.000)。DM组p-AKT、总Nrf2、核Nrf2及HO-1蛋白的表达水平均较NC组显著降低(P=0.000)，Caspase-3蛋白表达水平较NC组明显升高(P=0.000)；与DM组比较，tBHQ组p-AKT、总Nrf2、核Nrf2及HO-1蛋白的表达水平均明显增加(P=0.000)，Caspase-3蛋白表达水平明显降低(P=0.017)；AKT蛋白表达水平在3组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Nrf2/ARE通路与PI3K/AKT通路相互作用对抑制胰岛细胞Caspase-3的表达及延缓胰岛细胞凋亡进程产生重要的保护作用。

半胱天冬酶-3；糖尿病，2型；胰岛；细胞凋亡；Nrf2/ARE通路；PI3K/AKT通路；氧化性应激

磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(serine/threonine protein kinase,AKT)通路已被证明在调控胰岛细胞凋亡方面发挥着重要作用。Li等[1]研究发现，人胰岛淀粉样多肽(human islet amyloid polypeptide,hIAPP)聚集可导致2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)胰岛B细胞损伤、凋亡，这与氧化应激对PI3K/AKT通路的抑制作用不断增强，进而激活重组人半胱天冬酶-3、8、9(Caspase-3,8,9)有关。PI3K/AKT通路调控的其中一个下游信号蛋白为核因子相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)，通过激活Nrf2，使Nrf2/抗氧化反应元件(antioxidant responsive element,ARE)通路诱导血红素氧合酶1(hemeoxygenase-1,HO-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等抗氧化酶的表达，发挥抗氧化应激作用，而应用PI3K/AKT通路特异性抑制剂处理后，则可抑制Nrf2活性[2-3]。本研究通过激活Nrf2/ARE通路，观察对T2DM大鼠PI3K/AKT通路、Caspase-3蛋白表达及胰岛细胞凋亡的影响，以探讨Nrf2/ARE通路与PI3K/AKT通路相互作用对T2DM大鼠胰岛细胞的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康8周龄雄性Wistar大鼠，体质量180～200 g，由重庆腾鑫比尔实验动物销售公司提供。链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)购自美国Sigma公司；叔丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ)购自比利时Acros公司；丙二醛(malondialdehyde,MDA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自美国Omega公司；TUNEL试剂盒购自德国Roche公司；总蛋白、核蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗大鼠Nrf2多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；兔抗大鼠AKT单克隆抗体购自美国CST公司；兔抗大鼠p-AKT(Ser473)多克隆抗体购自美国CST公司；兔抗大鼠HO-1多克隆抗体购自美国Bioworld公司；兔抗大鼠Caspase-3单克隆抗体购自美国CST公司；兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体购自美国CST公司，辣根过氧化物酶(HRP)-山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立及分组 取60只雄性Wistar大鼠予以高糖、高脂饲料喂养，高糖、高脂饲料配方为普通饲料66.5%，蔗糖20.0%，猪油10.0%，胆固醇2.5%，胆酸盐1.0%[4]。喂养4周后，空腹8 h，一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg BW(用前以pH 4.3的0.1 mmol/L枸橼酸盐缓冲液配成1.0%的浓度)，高糖、高脂饲料继续喂养72 h后，空腹测尾静脉血糖大于或等于16.7 mmol/L为T2DM模型建立成功，共43只大鼠造模成功，采用随机数字表法将其分为两组：糖尿病模型组(DM组)20只，不用药物干预，在高糖、高脂饲料中添加1.0%面粉；tBHQ干预组(tBHQ组)20只，参照文献[5]的方法，在高糖、高脂饲料中添加1.0%tBHQ，余下的3只T2DM大鼠剔除。同时，另取20只Wistar大鼠作为正常对照组(NC组)，不用药物干预，在普通饲料中添加1.0%面粉。3组大鼠连续干预8周后处死，穿刺心脏收集全血并离心，取血清放入-20 ℃冰箱冻存待测，收集胰腺组织，放入-80 ℃冰箱冻存备检。

1.2.2 胰岛细胞凋亡观察及细胞凋亡率计算 各组胰腺组织切片采用TUNEL法检测，操作严格按照TUNEL试剂盒说明书进行。在200倍光镜下观察凋亡细胞核(棕黄色)和未发生凋亡的细胞核(蓝色)。每张切片至少选取3～5个胰岛在高倍视野(×400)下计算胰岛细胞凋亡率，凋亡率=凋亡细胞核数/总细胞核数×100%。

1.2.3 MDA检测 采用ELISA法检测血清及胰腺组织中MDA水平，测定方法按照MDA ELISA试剂盒使用说明，取大鼠胰岛数目含量最多的胰尾组织约100 mg，加入RIPA裂解缓冲液，12 000 r/min低温离心10 min，在酶标包被板上分别设标准品孔、空白对照孔、待测样品孔。将50 μL标准品加入标准品孔中，先后将10 μL和40 μL待测样品稀释液加到待测样品孔中，空白对照孔不加任何液体。然后加入抗体工作液和酶标抗体工作液继续反应，最后加入底物工作液反应后在450 nm波长处对每孔的光密度(OD)值进行测量，根据标准品的浓度和OD值算出MDA浓度。

1.2.4 Western blot检测目的蛋白 取大鼠胰岛数目含量最多的胰尾组织约100 mg，加入RIPA裂解缓冲液，12 000 r/min低温离心10 min，取上清液即得胰腺组织总蛋白，胰腺组织核蛋白的提取严格按照凯基生物核蛋白提取试剂盒说明书操作。用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，取等量蛋白电泳并转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，室温下封闭后，滴加AKT(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)、Nrf2(1∶800)、HO-1(1∶500)、Caspase-3(1∶1 000)一抗溶液，以及标准内参GAPDH(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜后加入HRP-山羊抗兔IgG二抗溶液，室温孵育1 h，电化学发光(ECL)显色，Bio-Rad凝胶成像系统成像，Quantity-One测灰度值并分析。实验重复4次，取平均值。

2 结 果

2.1 各组大鼠胰岛细胞凋亡率的比较 凋亡细胞缩小，细胞核染色质浓缩、碎裂。DM组胰岛细胞凋亡率[(26.42±6.93)%]较NC组[(7.05±2.81)%]显著增加(P=0.000)，tBHQ组胰岛细胞凋亡率[(13.62±3.77)%]较DM组明显减少(P=0.000)，见图1。

A:NC组；B：DM组；C：tBHQ组。

图1 各组大鼠胰岛细胞凋亡观察(TUNEL，×200)

2.2 各组大鼠血清及胰腺组织中MDA水平的比较 DM组血清及胰腺组织中MDA水平较NC组明显升高(P=0.000)，tBHQ组血清及胰腺组织中MDA水平较DM组明显降低(P=0.000)，见表1。

表1 各组大鼠血清及胰腺组织中MDA水平 比较

a：P<0.01，与NC组比较；b：P<0.01，与DM组比较。

2.3 各组大鼠胰腺组织AKT、p-AKT、总Nrf2、核Nrf2、HO-1和Caspase-3蛋白表达的比较 Western blot结果显示：DM组p-AKT、总Nrf2、核Nrf2及HO-1蛋白的表达水平均较NC组显著降低(P=0.000)，Caspase-3蛋白表达水平较NC组明显升高(P=0.000)；与DM组比较，tBHQ组p-AKT、总Nrf2、核Nrf2及HO-1蛋白的表达水平均明显增加(P=0.000)，Caspase-3蛋白表达水平明显降低(P=0.017)；AKT蛋白表达水平在3组间差异无统计学意义(P>0.05)，见图2、表2。

图2 各组大鼠胰腺组织AKT、p-AKT、总Nrf2、 核Nrf2、HO-1、Caspase-3蛋白表达表2 各组大鼠胰腺组织各蛋白表达的相对强度比较±s)

组别nAKTp⁃AKT总Nrf2核Nrf2HO⁃1Caspase⁃3NC组40．99±0．081．36±0．221．12±0．141．01±0．090．89±0．070．54±0．04DM组40．99±0．090．50±0．04a0．58±0．05a0．48±0．07a0．58±0．05a1．32±0．21atBHQ组41．02±0．131．03±0．11b1．31±0．20b1．52±0．25b1．54±0．27b1．03±0．15bF1．23942．85836．40951．41659．63448．195P0．3350．0000．0000．0000．0000．000

a：P<0.01，与NC组比较；b：P<0.01，与DM组比较。

3 讨 论

PI3K/AKT通路与Nrf2/ARE通路形成的PI3K/AKT-Nrf2/ARE通路在调节机体氧化应激方面发挥着重要作用[6-7]。PI3K/AKT通路在机体各组织与细胞中广泛存在，通过抑制Caspase家族活性来调控细胞凋亡周期[8]。Caspase家族是细胞凋亡环节中的主要参与者，Caspase-3在该环节中扮演着主要角色，Caspase-3激活与过度表达均可引起细胞凋亡信号转导级联反应的进一步放大，最终使细胞发生凋亡[9]。

Tie等[10]通过研究氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)对内皮祖细胞(EPCs)PI3K的亚基p85及AKT的影响发现，oxLDL可使p85亚硝基化，并显著降低p-AKT/AKT比值，进而诱导EPCs凋亡，这一改变可通过离体抗氧化治疗逆转，提示氧化应激反应可干扰PI3K/AKT通路信号转导，导致EPCs凋亡。根据PI3K/AKT信号转导通路特点，PI3K与AKT结合后，先后将AKT的两个位点(Thr308和Ser473)磷酸化，从而使AKT完全活化[11-12]，在本研究中，DM组p-AKT蛋白低表达提示其未被激活或未完全活化。同时，DM组Caspase-3蛋白表达水平上调，胰岛细胞凋亡率显著增加，说明PI3K/AKT通路失活后对Caspase-3的抑制作用减弱，从而促使胰岛细胞凋亡。由于PI3K/AKT通路可诱导下游靶基因Nrf2的转录，进而使其磷酸化入细胞核与ARE结合，并上调抗氧化酶HO-1蛋白的表达，发挥细胞保护功能，而未磷酸化入细胞核的Nrf2在细胞质中被泛素化降解[13]。因此，本研究通过检测Nrf2、HO-1、MDA指标来反映抗氧化应激能力和胰岛细胞氧化应激水平。结果显示，DM组抗氧化应激能力明显减弱，胰岛细胞处于高氧化应激状态，证明氧化应激可阻碍PI3K/AKT通路信号转导，而PI3K/AKT通路活性降低可导致Nrf2激活障碍、入核减少，并促进其被泛素化降解，从而引起Nrf2总蛋白、核蛋白表达水平均降低。由此，笔者推测，Nrf2/ARE通路活性降低或激活障碍，可下调HO-1蛋白的表达水平，导致PI3K/AKT通路更容易受到氧化应激的攻击损伤，使Caspase-3活性逐渐增强，如此循环往复，最终加速了胰岛细胞凋亡进程。

由于DM组Nrf2/ARE通路处于活性降低或失活状态，据此，本研究选用Nrf2/ARE通路特异性激活剂tBHQ对T2DM大鼠进行为期8周的干预和观察[14]。结果发现，tBHQ组抗氧化应激能力明显增强，胰岛细胞氧化应激水平明显降低，提示Nrf2/ARE通路被激活后，可抑制Nrf2在细胞质中被泛素化降解，增加其磷酸化入核率，进而上调抗氧化酶表达，降低胰岛细胞氧化应激水平[15]。同时，tBHQ组AKT磷酸化水平增强，并伴随着Caspase-3蛋白表达水平下调，胰岛细胞凋亡率明显降低，由此说明激活Nrf2/ARE通路可减轻氧化应激对PI3K/AKT通路的影响，进而抑制Caspase-3蛋白活性，使胰岛细胞凋亡明显减少。

综上所述，Nrf2/ARE通路通过抗氧化应激作用，保护PI3K/AKT通路的正常信号转导，而PI3K/AKT通路可介导Nrf2蛋白表达，发挥Nrf2/ARE通路抗氧化应激活性。两者相互作用、相互渗透，对抑制胰岛细胞Caspase-3的表达及延缓胰岛细胞凋亡进程起着重要的保护作用。

[1]Li XL,Wong YS,Xu G,et al.Selenium-enriched Spirulina protects INS-1E pancreatic beta cells from human islet amyloid polypeptide-induced apoptosis through suppression of ROS-mediated mitochondrial dysfunction and PI3/AKT pathway[J].Eur J Nutr,2015,54(4):509-522.

[2]Min KJ,Lee JT,Joe EH,et al.An IκBα phosphorylation inhibitor induces heme oxygenase-1(HO-1) expression through the activation of reactive Oxygen species(ROS)-Nrf2-ARE signaling and ROS-PI3K/Akt signaling in an NF-κB-independent mechanism[J].Cell Signal,2011,23(9):1505-1513.

[3]Zou W,Chen C,Zhong Y,et al.PI3K/Akt pathway mediates Nrf2/ARE activation in human L02 hepatocytes exposed to low-concentration HBCDs[J].Environ Sci Technol,2013,47(21):12434-12440.

[4]Chun L,Junlin Z,Aimin W,et al.Inhibition of ceramide synthesis reverses endothelial dysfunction and atherosclerosis in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Diabetes Res Clin Pract,2011,93(1):77-85.

[5]Nouhi F,Tusi SK,Abdi A,et al.Dietary supplementation with tBHQ,an Nrf2 stabilizer molecule,confers neuroprotection against apoptosis in amyloid β-injected rat[J].Neurochem Res,2011,36(5):870-878.

[6]Wang L,Wang R,Jin M,et al.Carvedilol attenuates 6-hydroxydopamine-induced cell death in PC12 cells:involvement of Akt and Nrf2/ARE pathways[J].Neurochem Res,2014,39(9):1733-1740.

[7]Li L,Dong H,Song E,et al.Nrf2/ARE pathway activation,HO-1 and NQO1 induction by polychlorinated biphenyl quinone is associated with reactive oxygen species and PI3K/AKT signaling[J].Chem Biol Interact,2014,25(209):56-67.

[8]Liu C,Yang J,Fu W,et al.Coactivation of the PI3K/Akt and ERK signaling pathways in PCB153-induced NF-κB activation and caspase inhibition[J].Toxicol Appl Pharmacol,2014,277(3):270-278.

[9]Green DR.Apoptotic pathways:paper wraps stone blunts scissors[J].Cell,2000,102(1):1-4.

[10]Tie G,Yan J,Yang Y,et al.Oxidized low-density lipoprotein induces apoptosis in endothelial progenitor cells by inactivating the phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway[J].J Vasc Res,2010,47(6):519-530.

[11]Tsuchiya A,Kanno T,Nishizaki T.PI3 kinase directly phosphorylates Akt1/2 at Ser473/474 in the insulin signal transduction pathway[J].J Endocrinol,2013,28(1):49-59.

[12]Risso G,Blaustein M,Pozzi B,et al.Akt/PKB:one kinase,many modifications[J].Biochem J,2015,468(2):203-214.

[13]Li L,Dong H,Song E,et al.Nrf2/ARE pathway activation,HO-1 and NQO1 induction by polychlorinated biphenyl quinone is associated with reactive oxygen species and PI3K/AKT signaling[J].Chem Biol Interact,2014,209(25):56-67.

[14]Zagorski JW,Turley AE,Dover HE,et al.The Nrf2 activator,tBHQ,differentially affects early events following stimulation of Jurkat cells[J].Toxicol Sci,2013,136(1):63-71.

[15]Giudice A,Arra C,Turco MC.Review of molecular mechanisms involved in the activation of the Nrf2-ARE signaling pathway by chemopreventive agents[J].Methods Mol Biol,2010(647):37-74.

Effect of interact between Nrf2/ARE and PI3K/AKT pathways on Caspase-3 expression of islet cell*

LiCheng1,2,XiaJiyi3,WanQin1△

(1.DepartmentofEndocrinology,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;2.DepartmentofEndocrinology,TheRongchangDistrictPeople′sHospital,Chongqing402460,China;3.ResearchCenterforDrugandFunctionalFood,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To explore the effect and possible mechanisms of the interact between Nrf2/ARE and PI3K/AKT pathways on the islet cell apoptosis and Caspase-3 protein expression of type 2 diabetic rats.Methods Sixty male Wistar rats were randomly divided into the normal control group(NC group，n=20),diabetic model group(DM group，n=20)and tertiary-butylhydroquinone intervention group(tBHQ group，n=20).All rats were killed after eight weeks of intervention.TUNEL was used to determine islet cell apoptosis.ELISA was used to determine MDA levels in serum and pancreatic tissues,and Western blot was used to detect the protein expression levels of AKT,p-AKT,total Nrf2,nulear Nrf2,HO-1,Caspase-3 in pancreatic tissues.Results Compared with the NC group,the apoptosis rate of islet cells in the DM group was significantly increased(P=0.000).The apoptosis rate of islet cells in the tBHQ group was significantly lower than that in the DM group(P=0.000).Compared with the NC group,the MDA levels in serum and pancreatic tissue in the DM group were significantly increased(P=0.000),while the serum and pancreatic tissue levels of MDA in the tBHQ group were significantly lower than those in the DM group.The protein expression levels of p-AKT,total Nrf2,nulear Nrf2 and HO-1 in the DM group were significantly lower than those in the NC group(P=0.000),while the protein expression level of Caspase-3 was significantly higher than that in the NC group(P=0.000).The tBHQ group had significantly higher protein expressions of p-AKT,total Nrf2,nulear Nrf2 and HO-1 than the DM group(P=0.000),while the protein expression level of Caspase-3 was significantly decreased(P=0.017).AKT protein expression level had no statistically significant difference among the three groups(P>0.05).Conclusion The interact between Nrf2/ARE and PI3K/AKT pathways generates an important protective effect on inhibiting the expression of Caspase-3 in islet cell and delaying the process of islet cell apoptosis.

Caspase-3;diabetes mellitus,type 2;islets of langerhans islet;apoptosis;Nrf2/ARE pathway;PI3K/AKT pathway;oxidative stress

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.03.002

四川省教育厅科研计划资助项目(15ZB0153)。 作者简介：李程(1986-)，主治医师，硕士，主要从事糖尿病及其并发症方面研究。△

R587.1

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1671-8348(2017)03-0292-04

2016-07-18

2016-10-16)