怀牛膝不同溶剂提取物抑菌活性

郭婕+李季平

牛膝为苋科牛膝属植物牛膝的干燥根，产于河南、山东、江苏等地，但以河南沁阳、武陟一带所产“怀牛膝”疗效好、产量大，是闻名国内外的“四大怀药”之一。它应用历史悠久，始载《神农本草经》，列为上品。本品味苦、酸，平。归肝、肾经；具有补肝肾、强筋骨、逐瘀通经、引血下行之功效。

怀牛膝含有甾体类、糖类、氨基酸、生物碱类、香豆素类等化合物，并含有钾盐及多种微量元素。多糖在中药材中分布非常普遍，牛膝多糖具有提高肌体免疫功能、一直肿瘤生长及升高白细胞等多种生理活性，具有一定的抗氧化作用。近年来，随着研究方法和技术的不断提高，发现了新的生理作用，使怀牛膝的研究进入了新的阶段。本文对怀牛膝的四种不同溶剂浸提液进行多糖含量测定，同时进行抑菌活性研究，探究怀牛膝提取物对不同菌株的抑菌作用。

一、材料与方法

（一）实验材料与仪器

怀牛膝，购买于周口市同和堂药店，干燥，粉碎。菌株均由周口师范学院生命科学与农学学院微生物实验室提供。

细菌培养基：牛肉膏2.5 g，蛋白胨5 g，NaCl 2.5 g，琼脂8.5 g，500 mL蒸馏水，PH 7.0-7.2，121℃灭菌30 min。

马铃薯培养基：马铃薯20 g，蔗糖2 g，琼脂2 g，蒸馏水100 mL，PH 7.0-7.2，121℃灭菌30 min。

（二）提取液的制备

准确称取材料50 g，4份，剪碎，用75%乙醇、75%丙酮、75%甲醇、蒸馏水，以料液比1：3，中火微波4 min，浸泡24 h，抽滤，重复2次，并合并滤液。将滤液在烘干箱中50℃浓缩至50 mL备用。

（三）牛膝多糖含量的测定

多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，以葡萄糖为标准品。多糖在硫酸的作用下先水解成单糖分子，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，再以比色法测定。在测定多糖含量时，因难以得到相应的多糖对照品，而常以葡萄糖等单糖作为对照。测定结果则以单糖来表示多糖的含量。

1.绘制标准曲线

准确移取标准溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.8 mL浓度为250 ?g/mL的葡萄糖溶液，分置于试管中，各加蒸馏水补足至每管1.00 mL，再各加入6%的苯酚溶液1.00 mL，摇匀，依次加入98%的浓硫酸5mL，摇匀，静止15 min后，置于40℃的条件下30 min，冷却，于波长490 nm处测定吸光度D490nm。将待测管中葡萄糖浓度与吸光度作回归处理，得回归方程y=0.0270x-0.0094 R2=0.9946。

2.样品中多糖含量测定

从不同提取方法的粗提取液中各取出1 mL，用蒸馏水适当稀释即为待测液，代替标准液，于波长490 nm处测定吸光度。根据回归方程算出测量多糖的C0（?g/mL），按照以下公式计算提取物多糖的提取率（mg/g）。

提取率（mg/g）=C0VK×10-3/W

式中：C0-测量液多糖的浓度（?g/mL）；V-粗提取液体积（mL）；K-为稀释倍数；W-原料干重（g）。

（四）抑菌活性实验

1.抑菌液的制备

将利用四种溶剂提取得到的提取液于紫外灯光下灭菌40 min，将灭菌的滤纸片放入上述溶液浸泡15 min，对照组的滤纸片置于无菌生理盐水中进泡15 min。

2.实验操作

用滤纸片法，首先将以灭菌的固体培养基倒入无菌培养皿中，水平放置待凝固。用无菌吸管吸取0.1 mL菌悬液加入到凝固的培养皿上，用无菌三角涂布棒涂布均匀。将以涂布好的培养皿划分成4等分，作上标记，中间做对照。用无菌镊子将已灭菌的小圆滤纸片5 mm至于相对的部位。每个菌种做三个重复。最后细菌放于37℃恒温培养箱中培养24 h，霉菌置28℃恒温培养箱中培养48 h后，观察是否产生抑菌圈。

二、结果与讨论

（一）怀牛膝多糖的测定

结果表明，相同实验条件下，各溶剂对样品多糖的提取率顺序为蒸馏水﹥75%乙醇﹥75%甲醇﹥75%丙酮。其中怀牛膝的提取液中，蒸馏水对多糖的提取率较高为15.51 mg/g；其次是75%乙醇，对多糖提取率为13.45 mg/g；75%丙酮对多糖提取率最低为7.45 mg/g。

（二）抑菌活性实验结果

采用滤纸片法研究怀牛膝多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、根霉、曲霉的抑菌效果，以抑菌圈的有无和抑菌圈的直径的大小为指标，实验结果见表1。

结果显示，蒸馏水、75%甲醇、75%乙醇、75%丙酮四种溶剂浸提液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌有一定的抑制效果，各提取液的抑菌作用强度是75%乙醇>75%甲醇>75%丙酮>蒸馏水。其中，同一种提取液对不同菌种的抑菌作用强度依次为枯草杆菌>大肠杆菌>金黄色葡萄球菌>根霉、曲霉，但是75%甲醇提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌作用无明显差别。总体来说，各种提取液对细菌的抑菌效果较好，对真菌没有明显的抑菌活性。

三、结论

本实验采用微波辅助法提取怀牛膝多糖，结果表明不同提取剂对多糖的提取率存在明显差别，其中蒸馏水对多糖的提取率较高为15.51 mg/g；其次是75%乙醇，对多糖提取率为13.45 mg/g；75%丙酮对多糖提取率最低为7.45 mg/g。并采用滤纸片法，以抑菌圈的有无和抑菌圈的直径的大小为指标，研究怀牛膝多糖提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、根霉、曲霉的抑菌效果。结果显示，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌培养基上出现明显的抑菌圈，根霉、曲霉培养基上无明显抑菌圈，因此怀牛膝多糖提取液对细菌的抑菌效果较好。但植物提取液成分较为复杂，具体是哪种化合物对抑菌活性起着关键性作用，还需进一步研究。

基金项目：2015年河南省高等学校重点科研项目（编号：15A180065）