雷公藤皮质部和木质部对小鼠毒性反应差异观察

李园园盛安琪施佳君寿旗扬傅惠英

1.浙江中医药大学第二临床医学院 杭州 310053 2.浙江中医药大学动物实验研究中心3.浙江中医药大学药学院

雷公藤皮质部和木质部对小鼠毒性反应差异观察

李园园2盛安琪3施佳君2寿旗扬2傅惠英1

1.浙江中医药大学第二临床医学院 杭州 310053 2.浙江中医药大学动物实验研究中心3.浙江中医药大学药学院

[目的]观察雷公藤皮质部和木质部水提物对小鼠毒性反应差异。[方法]将36只雌性ICR小鼠随机分为雷公藤木质部组、雷公藤皮质部组和空白组。分别灌胃给予木质部、皮质部水提物和生理盐水，1次/d，共19 d，期间记录小鼠体重变化情况。末次给药后，心脏取血，检测小鼠丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血清肌酐（serum creatinine，SCr）、尿酸（uric acid，UA）及血常规；HE染色观察小鼠小肠、肝和肾组织形态学的改变。[结果]与空白组相比，雷公藤木质部组和皮质部组小鼠体重显著降低（P＜0.05，P＜0.01），出现明显的体征变化，血清ALT、AST、SCr、UA均有不同程度的升高（P＜0.05，P＜0.01），血常规多项指标发生异常；病理观察显示雷公藤木质部组和皮质部组小鼠的肠壁显著变薄（P＜0.05，P＜0.01），小肠、肝和肾组织形态均受到了一定程度的损伤，且木质部组更为严重。[结论]雷公藤皮质部和木质部具有相似的肠、肝、肾毒性，可以考虑雷公藤皮质部作为雷公藤提取物制剂原料。

雷公藤；木质部；皮质部；毒性

雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.f.为卫茅科雷公藤属植物，近20年来，随着对雷公藤化学成分及药效毒理的深入研究，以雷公藤为原料制成的制剂具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等作用，广泛用于治疗类风湿、红斑狼疮、银屑病、肾炎、肿瘤等各类疾病，市场需求量不断扩大，其野生资源遭受严重的破坏[1-3]。为保障雷公藤产业的可持续发展，积极开展雷公藤人工栽培及扩大雷公藤的药用部位等研究日益受到关注。

一般认为，雷公藤根皮毒性较大，故常常将根皮去除后入药。但近年来的研究表明，雷公藤的根皮同样具有临床应用价值。有文献报道雷公藤根木质部和根皮HPLC指纹图谱上的峰数和峰形基本相同，但含量要高于木质部[4]。课题组前期比较了雷公藤根木质部和皮质部6个主要单体成分，包括雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲等，也均高于木质部，尤其是雷公藤红素高达100多倍[5]，提示雷公藤根皮部可考虑作为雷公藤提取物制剂的原料来源。但目前对雷公藤根皮部的毒性研究报道较少，然而药物毒性是新药研发过程中的重要障碍，药材用药部位的不同可能会产生安全问题，进而影响新药制剂的安全性。为此，本实验观察雷公藤木质部和皮部水提物对小鼠毒性反应差异，为进一步扩大雷公藤药用部位提供依据。

1 材料

1.1 药物 雷公藤药材，2015年5月份从浙江金华山上新鲜采挖。剥离雷公藤皮部和木质部，晒干，切段。取等量药材水煮2次，1h/次，合并滤液，浓缩。

1.2 试剂 10%中性缓冲甲醛：37%甲醛与0.01mol· L-1磷酸缓冲液1:9配制；苏木素染液和0.5%伊红染液配制（自配），用于组织切片的HE染色。丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、血尿素氮（blood ureanitrogen，BUN）、 血 清 肌 酐（serum creatinine，SCr）、尿酸（uric acid，UA）等试剂盒均购自上海申能-德赛诊断技术有限公司，批号分别为：07195/00001949、07218/00001951、07139/00001763、171035/50002289、07192/00001987。

1.3 动物 健康雌性ICR小鼠（SPF）36只，8周龄，体质量20g左右，购于上海斯莱克实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002。

1.4 仪器 AG204-电子分析天平（瑞士METTLER）；日立7020全自动生化分析仪（日立公司）；STP120脱水机、AP280-2包埋机、HM335E切片机（MICROM公司）；MLS-3020高压灭菌锅（日本三洋公司）；BG-270隔水式电热恒温箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；Nikon eclipse 80i显微镜（Nikon公司）；ADVIAR 2120i血液分析仪（西门子公司）。

2 方法

2.1 动物分组与给药 将36只小鼠随机分为3组，雷公藤木质部组12只，雷公藤皮质部组12只，空白组12只。各组小鼠体质量差异无统计学意义（P＞0.05）。灌胃给药，根据文献[6]雷公藤临床等效量为3.25g·kg-1，雷公藤根皮部毒性甚于木质部，本实验取临床等效量的近8倍量，按生药计雷公藤皮质部组剂量为12g·kg-1，雷公藤木质部组剂量为24g·kg-1，空白组给予等体积的生理盐水，各组均1次/d，连续19d。每日观察小鼠大便性状，毛色、活动及体重变化情况。

2.2 对小鼠肝、肾、肠组织形态的影响 肉眼观察小鼠肠组织肠壁厚度及粘膜的变化。分别取新鲜肝、肾、适当长度肠组织于甲醛中固定，石蜡包埋，连续切片，HE染色光镜观察组织形态学变化。

2.3 对小鼠肝、肾功能的影响 各组动物末次给药后，用0.3%的戊巴比妥钠（0.015mL·g-1）腹腔麻醉，心脏取血。将血液静置30min，3000r/min离心10min，取血清，全自动生化分析仪测定ALT、AST、BUN、SCr、UA及血常规。

2.4 统计学方法 使用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料用平均数±标准差（x±s）表示，多样本均数比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），组间两两比较采用LSD法，两样本间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况 给药7d后，雷公藤木质部组和皮质部组小鼠食欲降低，大便开始呈现不规则形态，偏潮湿，小鼠活动量减少，无力；空白组小鼠进食及大便正常，健康活泼，未见异常。末次给药后剖腹观察，肉眼可见雷公藤木质部组和皮质部组小鼠肠壁明显变薄、透明，空白组小鼠肠道未见异常。

3.2 雷公藤木质部及皮质部水提物对小鼠体重的影响 与空白组比较，雷公藤木质部组和皮质部组小鼠给药第7d后体重均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），且雷公藤皮质部组小鼠体重较雷公藤木质部组下降明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

3.3 雷公藤木质部和皮质部水提物对小鼠血常规的影响 与空白组比较，雷公藤木质部组和皮质部组嗜酸性细胞数均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），单核细胞数和平均血红蛋白浓度均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与空白组比较，雷公藤皮质部组中性粒细胞显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与雷公藤木质部组比较，雷公藤皮质部组血小板、网织红细胞均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01），而网织红细胞分布宽度和网织红细胞血红蛋白分布宽度显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图2。

图1 雷公藤木质部和皮质部水提物对小鼠体重影响Fig.1 The effect on body weight of mice treatment with the cortex and xylem extract of common threewingnut root

图2 雷公藤木质部和皮质部水提物对小鼠血常规影响Fig.2 The blood test of mice treatment with the cortex and xylem extract of common threewingnut root

3.4 雷公藤木质部和皮质部水提物对小鼠小肠及肝、肾功能的影响 对小鼠肠壁观察显示：与空白组比较，雷公藤木质部组和皮质部组小鼠肠壁厚度均显著变薄（P＜0.05，P＜0.01），且雷公藤木质部组较雷公藤皮质部组严重（P＜0.05）；对小鼠肝、肾功能检测显示：与空白组比较，雷公藤木质部组和皮质部组ALT、AST、SCr和UA含量均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），但雷公藤木质部组与皮质部组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图3 雷公藤木质部和皮质部水提物对小鼠肝、肾功能的影响Fig.3 The effects on function of liver and kidney of mice treatment with the cortex and xylem extract of common threewingnut root

3.5 雷公藤木质部和皮质部水提物对小鼠肝、肾及肠组织形态学影响

3.5.1 雷公藤木质部和皮质部水提物对小鼠肠道组织形态学影响 对小肠组织形态学观察结果显示：空白组小鼠肠道组织外观无异常，结构清晰，镜下观察小肠粘膜完整，固有层内肠腺丰富，排列紧密；与空白组比较，雷公藤木质部组和皮质部组小鼠小肠肠壁变薄，镜下观察粘膜坏死脱落，粘膜及粘膜下层有大量炎症细胞浸润，腺体细胞大量消失，且雷公藤木质部组病变更为严重。见图4。

图4 各组小鼠小肠组织病理结果（HE，100×）Fig.4 The pathological section of small intestinum tissue in mice(HE,100×)

3.5.2 雷公藤木质部和皮质部水提物对小鼠肝组织形态学影响 对小鼠肝组织形态学观察结果显示：空白组小鼠肝脏结构清晰，小叶中央静脉结构完整，肝细胞形态正常，汇管区清晰可见；与空白组比较，雷公藤木质部组和皮质部组小鼠肝细胞出现一定的脂肪变性、水肿及散在嗜酸性变，肝窦部分消失，肝细胞排列不规则，且雷公藤木质部组病变更为严重。见图5。

3.5.3 雷公藤木质部和皮质部水提物对小鼠肾组织形态学影响 对小鼠肾组织形态学观察结果显示：空白组小鼠肾小管和肾小球结构完好，未见上皮细胞和系膜细胞增生等病理变化；与空白组比较，雷公藤木质部组和皮质部组小鼠肾脏肾小球明显增大，肾小囊变窄，内皮细胞和系膜细胞增生，并有肾小球发生球囊粘连，肾小管上皮细胞发生变性，肾间质内有炎症细胞浸润。见图6。

4 讨论

图5 各组小鼠肝组织病理结果（HE，200×）Fig.5 The pathological section of liver tissue in mice(HE,200×)

图6 各组小鼠肾组织病理结果（HE，100×）Fig.6 The pathological section of kidney tissue in mice(HE,100×)

雷公藤在临床应用中致消化系统的不良反应发生率较高，其损害在正常剂量范围内即可发生，多表现为呕吐、腹痛腹泻、纳差、腹胀等[7]。本实验通过对小鼠大便、小肠厚度和组织形态学观察，发现雷公藤木质部和皮质部均可以导致小鼠腹泻、肠道壁变薄，肠绒毛破损等严重不良反应，且雷公藤木质部更为严重；但在体重指标上，雷公藤皮质部较木质部显著的降低了小鼠体重，提示皮质部可能通过降低机体的营养吸收使小鼠体重减轻。

雷公藤有骨髓抑制作用，可引起白细胞及血小板减少，严重者可发生粒细胞缺乏、贫血和再生障碍性贫血[8]，本实验通过对给予雷公藤木质部和皮质部水提物小鼠血常规观察，发现两者对白细胞总数影响不明显，但嗜酸性细胞比率增高，这可能跟药物引起机体过敏反应有关，包括雷公藤皮质部引起的中性粒细胞显著升高；单核细胞比率降低，可能跟药物抑制骨髓作用有关。此外，雷公藤木质部血小板、网织红细胞数量极其显著下降，提示雷公藤木质部对骨髓造血系统影响较雷公藤皮质部明显。

肝脏是雷公藤最主要和损伤最严重的毒性靶器官之一，雷公藤引起肝损害的临床表现类似于急性病毒性肝炎，病理可见肝实质性改变，细胞排列紊乱等现象[9]；常规剂量很少发生肾毒性，极少数患者在服药1个月～2个月后出现面部浮肿、蛋白尿、红细胞管型、肌酐和尿素氮升高[10]。本实验对给予雷公藤木质部和皮质部水提物小鼠ALT、AST、SCr、UA的检测发现，肝、肾功能均有不同程度的损伤，但两者之间无明显差异。病理形态学显示，雷公藤木质部组和皮质部组的肝、肾均发生一定程度的病变，雷公藤木质部组尤为明显。

综上所述，雷公藤皮质部在有效成分含量远远高雷公藤于木质部情况下，对小肠、血常规及肝肾功能的毒性与雷公藤木质部比较并没有显著差异，因此可以考虑作为雷公藤提取物制剂原料使用；但雷公藤皮质部组在体重方面显著低于雷公藤木质部，提示雷公藤皮质部可能还有其他关键毒性作用部位，有待进一步深入研究。

References:

[1] 胡攀勇,李振麟,濮社班,等.雷公藤研究进展[J].中国野生植物资源,2013,32(2):1-3，7. HU Panyong,LI zhenlin,PU Sheban,et al.Research Advances on Triptreygium wilfordii[J].China Wild PlantResources,2013,32(2):1-3，7.

[2] 张鑫,武祯,李航.雷公藤多甙片药理学研究进展及临床应用[J].临床药物治疗杂志,2014,12(4):8-13. ZHANG Xin,WU Zhen,LI Hang.A Review of Pharmacological Research Progress and Clinical Use on Multiglycoside of Tripterygium Wilfordii Hook,f Tablet[J].Clinical Medication Journal,2014,12(4):8-13.

[3] 薛冠明,薛蕾,闫德友.雷公藤化学成分、生物活性及其资源利用概述[J].青海农林科技,2013（4）:24-28. XUE Guanming,XUE Lei,YAN Deyou.A Overview of Chemical Ingredient,Biological Activity and Resource U-tilization of Tripterygium wilfordii[J].Science and Technology of Qinghai Agriculture and Forestry,2013（4）:24-28.

[4] 林文津,于虹敏,徐榕青,等.雷公藤根木质部与根皮HPLC指纹图谱比较研究[J].药物分析杂志,2013,33(3):419-423. LIN Wenjin,YU Hongmin,XU Rongqing,et al.Fingerprint chromatogram analysis of the root xylems and root barks from Tripterygium wilfordii Hook.F.by HPLC[J].Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis,2013,33(3):419-423.

[5] 张少燕,范永升,沈炜,等.雷公藤不同部位中6个单体成分的含量比较[J].中华中医药学刊,2013,5(31):1122-1125. ZHANG Shaoyan,FANG Yongsheng,SHEN Wei,et al. Comparative Study on Six Monomer Compositions in DifferentParts of Tripterygium wilfordill Hook.F[J].Chinese ArchivesofTraditionalChinese Medicine,2013,5(31): 1122-1125.

[6] 王蓓,陈晨,余黎,等.雷公藤不同提取部位对小鼠肝肾的损伤作用[J].中国中医急症,2012,21(3):383-385. WANG Bei,CHEN Chen,YU Li,et al.Research of Different Extractions of Tripterygium on Hepatic and Kidney Injury on Mice[J].Journal of Emergency in Traditional Chinese Medicine,2012,21(3):383-385.

[7] 张贺,王芳,葛平,等.雷公藤不良反应及其配伍减毒增效研究进展[J].中国中医药信息杂志,2014,21(8):126-129. ZHANG He,WANG Fang,GE Ping,etal.Research Progress on the Toxicity of Tripterygium Wilfordii and Attenuated Synergistic Approaches[J].Chinese Journal of Information on TCM,2014,21(8):126-129.

[8] 黄明来,马卓.雷公藤的研究进展[J].化学与生物工程,2012, 29(7):1-4. HUANG Minglai,MA Zhuo.The Research Progress of Tripterygium Wilfordii[J].Chemistry and Bioengineering,2012, 29(7):1-4.

[9] 曹玲娟,颜苗,李焕德,等.雷公藤致肝损伤及与甘草配伍减毒机制的研究进展[J].中国中药杂志,2015,40(13):2537-2541. CAO Lingjuan,YAN Miao,LI Huande,et al.Progress on mechanism of Tripterygium wilfordii-induced liver injury and detoxification mechanism of licorice[J].China Journal of Chinese Materia Medica,2015,40(13):2537-2541.

[10]高丽,白赟,柴智,等.雷公藤毒性反应研究进展[J].中国中医药信息杂志,2012,19(4):107-110. GAO Li,BAI Yun,CHAI Zhi,et al.Research Progress on toxicity of the toxic reaction of the hook[J].Chinese Journal of Information on TCM,2012,19(4):107-110.

The Toxic Effects of Tripterygium Wilfordii Root Cortex and Xylem Extraction on Mice

LI Yuanyuan,2SHENG Anqi3,SHI Jiajun2,et al 1.The Second Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053);2.Laboratory Animal Research Center of Zhejiang Chinese Medical University;3.College of Pharmacy of Zhejiang Chinese Medical University

[Objective]To observe the toxic effects of the tripterygium wilfordii cortex and xylem water extract on mice.[Methods]36 female ICR mice were randomly divided into three groups:tripterygium wilfordii xylem extract group,tripterygium wilfordii cortex extract group and control group,intragastric administration once per day for total 19 days.Record the changes of body weight in mice,and take heart blood to detect alanine aminotransterase(ALT), aspartate aminotransferase(AST),urea nitrogen(BUN),serum creatinine(SCr),uric acid(UA)and routine blood with the last administration;HE staining to observe the liver,kidney and intestine tissue morphology changes.[Results]Compared with the control group,the weight of tripterygium wilfordii group and xylem cortex group of mice decreased significantly(P＜0.05,P＜0.01),there were obvious body sign changes with administration.ALT,AST,SCr,UA were markedly increased(P＜0.05,P＜0.01);Routine blood showed anomalies;Pathological histology observation showed intestinal wall significantly got thinner(P＜0.05,P＜0.01);Parenchymal cells of intestines,liver,kidney tissues were damaged with various degree,especially for xylem group.[Conclusion]Tripterygium wilfordii cortex and xylem have similar intestines,liver and kidney toxicity,which suggests tripterygium wilfordii cortex can be used as raw material for tripterygium wilfordii preparation

Tripterygium wilfordii;xylem;cortex;toxicity

R331

A

1005-5509（2017）01-0082-06

10.16466/j.issn1005-5509.2017.01.018

2016-09-12）

浙江省中医药管理局（2014ZQ013）；浙江省自然科学基金项目（LY13H280005）

Fund projects:Administration ofTraditionalChinese Medicine ofZhejiang Province(2014ZQ013);NaturalScience Foundtion of Zhejiang Province(LY13H280005)

傅惠英，E-mail:fhy131@126.com