尿毒清颗粒抑制大鼠肾脏间质纤维化作用靶点研究

陈琇萌，俞小敏*，肖洁

（广州医科大学附属第一医院肾内科，广东广州510120）

尿毒清颗粒抑制大鼠肾脏间质纤维化作用靶点研究

陈琇萌，俞小敏*，肖洁

（广州医科大学附属第一医院肾内科，广东广州510120）

目的研究尿毒清抑制大鼠肾脏间质纤维化的作用。方法采用单侧输尿管结扎术制备肾间质纤维化大鼠模型，将10周龄SPF级雄性大鼠60只，随机分3组：假手术(Sham，n=20)、模型组(UUO，n=20)和尿毒清治疗组（UNQ，n=20）；UNQ组于于术前1天给予尿毒清2 g/（kg·d）灌胃，假手术组及模型组每天灌胃等量生理盐水，各组分别于术后第3、7、14天处死5只大鼠，取梗阻侧肾脏进行组织学检查，对肾间质细胞浸润、肾小管萎缩和肾间质纤维化情况进行半定量评分；采用免疫组化、ELISA和Western Blot分别分析肾组织中转化生长因子β1(TGF-β1)、纤粘连蛋白(FN)表达。结果与Sham相比，UUO大鼠各时间点的病理损害进行性加重，肾小管间质中TGF-β1、FN表达均增高(P＜0.05)。与UUO相比，尿毒清治疗后3 d，可观察到大鼠的肾间质炎性细胞浸润、肾小管萎缩及肾间质纤维化(P＜0.05)明显减轻,同时肾组织中TGF-β1表达减少(P＜0.05)；治疗后7 d，上述治疗作用持续存在,同时进一步使UUO大鼠肾间质的FN表达下降(P＜0.05)；治疗14 d后,肾间质细胞浸润情况评分（CIS）和慢性病变(包括肾小管萎缩和间质纤维化)评分（AFS）较UUO组分别下降22.2%和19.1%(P＜0.05)，TGF-β1、FN的表达则较UUO组分别减轻30.8%和30%(P＜0.05)。结论尿毒清的保护作用表现在肾损伤的开始就通过减少TGF-β1表达从而使肾间质炎症细胞浸润受到抑制，同时还能减少病变肾组织细胞外基质的积聚，从而减轻肾间质纤维化。

尿毒清颗粒;肾脏间质纤维化;TGF-β1;单侧输尿管梗阻模型

本文引用：陈琇萌，俞小敏，肖洁.尿毒清颗粒抑制大鼠肾脏间质纤维化作用靶点研究[J].湖南中医药大学学报，2017，37（1）：33-37.

肾间质纤维化是各种不同原因的慢性肾脏病进展至终末期肾病的共同病理过程。肾功能的恶化，很大程度上取决于肾小管间质纤维化的程度。单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)模型是以进行性小管间质纤维化为特征的实验性肾病模型，为目前常用的肾间质纤维化模型[1]。目前研究认为，肾小管上皮细胞间充质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)促使肾间质纤维化，而EMT受多种细胞因子、生长因子和激素的调节，其中转化生长因子-β1（TGF-β1）是最重要的促纤维化因子，主要通过诱导其下游因子表达，启动并调节EMT的全过程，使细胞外基质显著增多。纤连蛋白(FN)是构成细胞外基质(ECM)的一种重要成分。ECM合成增多、降解减少，进而过度沉积导致了肾间质的纤维化[2-3]。尿毒清胶囊主要成分是大黄、黄芪、丹参、苦参、白术、茯芩、白芍、制何首乌、丹参、车前草等，是经过多年临床验证对慢性肾功能衰竭患者具有良好疗效的纯中药制剂。本研究通过建立UUO大鼠肾间质纤维化模型,动态观察肾脏间质纤维化的病理改变过程及尿毒清对该过程的影响,探讨尿毒清抗肾脏间质纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

尿毒清颗粒(规格:5g)购自内蒙古康臣药业（批号20130704）；10周龄SPF级雄性大鼠60只，200-250 g,广东省医学实验动物中心提供，许可证：SYXK（粤）2010-0104；兔抗大鼠TGF-β1、FN抗体购自Santa Cruz公司（批号sc-62839）,GDPDH抗体购自Biodesign公司,TGF-β1 ELISA试剂盒购自深圳晶美公司。主要仪器有：病理图像分析系统(Kodak公司)、电泳仪(Amersham公司)、酶标仪(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型建立实验鼠随机分为假手术组（Sham，n=20）、模型（UUO，n=20）和模型+治疗组（UNQ，n=20）。所有大鼠在SPF级实验室7 d适应。10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔麻醉，仰卧腹部正中切口2.5～3.5 cm，钝性分离暴露左侧肾盂输尿管连接部，在其下方1 cm处游离5 mm输尿管，用4～0线沿上端结扎两道，在两结扎点之间剪

断输尿管,然后逐层缝合，制备UUO模型。假手术组仅游离左侧输尿管但不结扎。

1.2.2 数据收集尿毒清按55-65 kg成人量15 g/d，折算尿毒清为0.23～0.27 g/(kg·d)，大鼠为人体剂量的9～10倍给药，配成1.0 g/mL药液，分上午、下午两次给药。UNQ组于术前1天予尿毒清2 g/(kg·d)灌胃，Sham组及UUO组每天灌胃等量生理盐水，各组分别于术后3、7、14 d下午处死5只大鼠。切除左肾，冷盐水洗净，留取肾门处横断面组织，用于免疫组化染色；剩余肾组织迅速置液氮保存备用。

1.3 检测方法

1.3.1 肾脏组织病理学检查及评分肾组织予HE和Masson染色，随机选取互不重叠10个视野400倍显微镜下观察,按下列标准对肾脏病理改变进行评分：肾间质细胞浸润评分(cell infiltration score, CIS)：无间质细胞浸润为0分、局灶细胞浸润1分、多灶细胞浸润2分、弥漫细胞浸润3分；包括肾小管萎缩和间质纤维化的慢性病变评分(atrophy and fibrosis score,AFS)：按病变面积占该视野的百分比计算，间质纤维化:无计0分、小于25%计1分、25%～50%计2分、大于50%计3分；肾小管萎缩:无计0分、小于25%计1分、25%～50%计2分、大于50%计3分。肾小管间质损伤程度由各评分均值表示。

1.3.2 免疫组织化学染色TGF-β1:石蜡切片大鼠肾组织3 μm厚脱蜡水化后，用0.3%过氧化氢-甲醇灭酶，微波修复，再用2%牛血清蛋白封闭20 min后加抗TGF-β1抗体(1∶200)4℃过夜；再加生物素标记二抗(1∶200)37℃30 min、辣根酶标记链酶卵白素(1∶200)37℃30 min，最后DAB显色。阴性对照用PBS代替一抗。FN应用胃蛋白酶修复后，其染色步骤与TGF-β1相似,使用的抗纤连蛋白抗体浓度为1∶50。

1.3.3 ELISA分析TGF-β1表达取出液氮中的肾组织放入RIPA缓冲液中，再冰上研磨直至组织完全溶解；在4℃中孵育60 min后在同一温度下14 000×g离心30 min；取出上清液，组织匀浆中的蛋白质浓度和TGF-β1浓度分别用劳马斯亮蓝法和ELISA法测定，校正用样品中的总蛋白浓度，TGF-β1水平用ng/g蛋白表示。

1.3.4 WesternBlot分析FN表达方法参照参考文献[4]，将上述肾组织匀浆煮沸变性后按200 mg蛋白/孔上样，使用7.5%SDS-PAGE胶电泳后转膜，5%脱脂牛奶封闭，加入抗纤连蛋白抗体和抗GAPDH抗体（1∶1 000）过夜,最后用辣根酶标记二抗（1∶5 000）显影，以GAPDH作为内参照。分析纤连蛋白及GAPDH电泳条带曝光强度使用图像分析软件，用对应相对丰度的比值表示纤连蛋白表达。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 尿毒清对肾脏组织病理变化的影响

光镜下（图1-2），Sham组空泡变性在肾小管上皮细胞偶见，肾间质有单核细胞灶状浸润。UUO组在造模后第3天出现扩张的肾小管及空泡变性的小管上皮细胞；肾间质可见水肿及多个灶状的细胞浸润和增生的梭形核细胞，肾间质有轻微纤维化改变。第7天时扩张的肾小管及空泡变性的小管上皮细胞更明显，肾间质出现水肿、细胞呈弥漫性增生并有局灶的纤维化。第14天肾小管上皮细胞出现弥漫萎缩，肾间质可见细胞浸润减轻而成纤维细胞明显增生，肾间质出现明显的纤维化生；但肾小球均则未见明显病变。与UUO组比较，尿毒清治疗后肾组织形态学变化均明显减轻但依然存在；UNQ组第3天CIS和AFS分别减少33.5%和41.9%(P＜0.05)；第7天时CIS和AFS分别下降26.2%和20.83%(P＜0.05)；在第14天时CIS和AFS分别下降22.2%和19.1%(P＜0.05)(表1-2)。

图1 假手术组、模型组和尿毒清治疗组7、14 d肾间质纤维化改变(HE染色，×200)

图2 假手术组、模型组和尿毒清治疗组7、14 d肾间质纤维化改变(Masson染色，×200)

2.2 尿毒清对肾组织TGF-β1表达的影响

如图3示，Sham组可见TGF-β1偶见在肾小球微弱表达。UUO组在造模后第3天就可见肾小管上皮细胞扩张，肾间质有少量散在的细胞浸润和TGF-β1高的表达，第7天时肾小管表达TGF-β1的数量明显增多，TGF-β1表达的强度也明显增高；到第14天TGF-β1表达仍继续增高。在UNQ组，第3、7、14天见肾小管上皮细胞扩张，细胞内散在表达TGF-β1且强度较低，肾间质偶见单核细胞浸润。肾组织匀浆中的TGF-β1蛋白水平用ELISA方法测定，结果发现（表3），Sham组TGF-β1水平在各时间点比较一致。UUO组的TGF-β1在第3天开始就和Sham组有差异，第7、14天表现为逐渐增高(P＜0.05)，在第3、7、14天分别是同期Sham组的1.81、2.35、2.62倍(P＜0.05)。UNQ组TGF-β1水平表现为持续增高趋势，第14天时是Sham组的1.81倍(P＜0.05)，但与UUO组比较TGF-β1水平在各时间点都表现为降低，分别降低48.1%、33.6%和30.8% (P＜0.05)。

表1 各组大鼠肾间质细胞浸润评分（±s，n=5）

表1 各组大鼠肾间质细胞浸润评分（±s，n=5）

注:与Sham组比较△P＜0.01;与UUO组比较▲P＜0.05;与3 d组比较★P＜0.05;与7 d组比较#P＜0.05。

组别3 d7 d14 dFP Sham0.10±0.230.15±0.18★0.10±0.11★#23.5260.012 UUO1.86±0.42△2.01±0.44△★3.03±0.34△★#15.1270.00 UNQ1.24±0.28△▲1.48±0.32△▲★2.34±0.26△▲★#10.2070.017 F18.8925.922.62 P0.000.000.00

表2 各组大鼠肾间质纤维化评分（±s，n=5）

表2 各组大鼠肾间质纤维化评分（±s，n=5）

注:与Sham组比较△P＜0.01;与UUO组比较▲P＜0.05;与3 d组比较★P＜0.05;与7 d组比较#P＜0.05。

组别3 d7 d14 dFP Sham0.00±0.000.10±0.09★0.05±0.12★#34.210.015 UUO1.34±0.28△3.56±0.23△★4.73±0.15△★#50.840.00 UNQ0.78±0.16△▲2.81±0.18△▲★3.85±0.12△▲★#45.260.00 F21.3530.1235.49 P0.000.000.00

图3 假手术组（A）、模型组（B）和尿毒清治疗组（C）14 d时TGF-β1表达(免疫组化×200)

表3 尿毒清对肾组织中TGF-β1表达的影响(±s,ng/g)

表3 尿毒清对肾组织中TGF-β1表达的影响(±s,ng/g)

注:与Sham组比较△P＜0.01;与UUO组比较▲P＜0.05;与7 d组比较★P＜0.05。

组别3 d7 d14 dFP Sham96.6±40.3588.52±50.3392.51±20.52 UUO174.82±50.15△208.02±59.25△242.38±62.45△★28.850.00 UNQ90.73±25.65▲138.12±35.89▲167.72±31.72▲★33.210.017 F29.55125.34217.231 P0.0000.0000.000

2.3 尿毒清对肾组织FN表达的影响

对FN的观察发现(图4):Sham组肾间质FN的表达为偶发、散在,肾小球和肾小管基底膜则表达轻微。UUO组FN主要表达在肾间质发生纤维化病变的区域，表达随时间延长而逐渐增强；FN在UNQ组与UUO组表达的部位相似，但前者的表达量显著减少。肾脏组织匀浆用Westernblot检测FN表达的结果发现（图5），Sham组未能检测到FN表达；UUO和UNQ两组在第3、7、14天检测到FN的表达均比Sham组的高，其中与UUO组比较，UNQ组在第7、14天FN的表达明显下降,分别为下降了45%和30%(P＜0.05)。

图4 假手术组(A)、模型组(B)和尿毒清治疗组(C)14 d时FN表达(免疫组化×200)

图5 Westernblot分析FN在各组大鼠的表达电泳图（上）及柱形图（下）

3 讨论

尿毒清颗粒含大黄、黄芪，研究发现大黄、黄芪有拮抗大鼠肾小管上皮细胞转分化的作用[5]。临床观察表明尿毒清颗粒有保护肾功能的作用。为探讨尿毒清在发病时究竟何时发挥保护作用以及其可能的主要作用点,我们在本实验中选用UUO大鼠模型进行了相关研究。UUO模型被认为是理想的肾间质纤维化模型。尿路梗阻导致输尿管内压升高，肾脏有效血流明显减少，肾素-血管紧张素系统和肾间质内的单核巨噬细胞系统的活化，致使白细胞、单核细胞在肾组织里浸润，并释放出能够破坏肾系膜细胞、小管上皮细胞、间质成纤维细胞及结构的各种酶和因子，从而导致肾脏间质出现纤维化[6-7]。另外，激活的单核巨噬细胞与同样激活的肾小管上皮细胞相互影响,导致肾组织TGF-β等激活[8]，与之相关的多种因子分泌升高，肾脏间质出现大量的炎症细胞，使得ECM的合成增加，肾脏间质纤维化发生；肾脏病理检查为小球大致正常而小管细胞表现为萎缩、间质表现为纤维化生[6-7,9]。在本研究中，动态观察了UUO组造模后第3、7、14天的肾脏病理改变，发现造模后肾小管间质的受损呈进行性加重，到第14天显著地表现为肾小管细胞萎缩、肾间质纤维化生。上述一系列的改变跟文献报告的UUO模型病变特点一致。经尿毒清治疗后，镜下检查可见，肾间质炎症细胞明显减少，同时肾小管细胞萎缩和间质纤维化生程度也显著减轻。本研究提示尿毒清的肾脏保护作用，在肾脏纤维化病变的发生过程中持续存在，且在该变化之前就已开始减轻肾组织的炎症反应。TGF-β1是由浸润到肾脏局部的单核巨噬细胞以及肾脏活化的固有细胞分泌，是致使ECM合成的细胞因子，在致病因素作用下会过度表达，从而使肾间质纤维化的发生。研究证实，TGF-β1除了可以激活间质成纤维细胞外，还通过Smad蛋白家族传递信号，从而增加ECM如FN的合成[10]。有文献报道，UUO制模10 h，就可以在梗阻侧的肾脏检测到TGF-β1mRNA开始增加,随后TGF-β1mRNA仍一直升高[11]。本研究发现，与UUO组比较，UNQ组造模后第3天就可见肾间质炎症细胞的浸润减少, TGF-β1表达因受到抑制而减少，在第7天及第14天该作用持续存在；从第7天开始FN表达显著下降，到第14天该表现仍持续存在，提示在梗阻性肾病的发展过程中尿毒清可能通过抑制EMT合成，或者下调TGF-β1表达从而减轻肾间质纤维化。

综上所述，在UUO模型中，尿毒清在病变开始就通过减轻炎症反应和减少TGF-β1分泌而使转分化的肾脏细胞减少，最后肾间质纤维化减轻，从而发挥其肾脏保护作用，该作用的高峰时间是在造模后7天。这些结果提示，今后研究尿毒清的肾脏保护作用机制可能应把重点放在发病的早期。

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（本文编辑 杨瑛）

Study on the Target of Niaoduqing Granule Inhibiting Renal Interstitial Fibrosis in Rats

CHEN Xiumeng,YU Xiaomin*,XIAO Jie
(Division of Nephrology,the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College,Guangzhou,Guangdong 510120,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Niaoduqing granule on renal interstitial fibrosis in rats.MethodsThe renal interstitial fibrosis rat models were built by unilateral ureteral obstruction(UUO).Ten weeks old male rats(n=60)were randomly divided into sham-operated group(Sham,n=20)，model group(UUO,n=20)and UUO treated with Niaoduqing group (UNQ,n=20).The rats in UNQ were treated with 2 g/kg·d Niaoduqing by gastric gavage on one day before the operation.The Sham and UUO groups were given a gavage of same volume normal saline every day.Five rats in each group were sacrificed on 3,7 and 14 days after surgery.The renal tubular interstitial fibrosis lesion and the expression of TGF-β1 and FN were detected by pathdogical examine and immunohistochemistry and ELISA and Western Blot.ResultsCompared with the Sham group,the number of infiltrated inflammatory cells in renal interstitial and the score of renal interstitial fibrosis was aggravated,TGF-β1 and FN expression were gradually increased in UUO group(P＜0.05).Compared with the UUO group, the number of infiltrated inflammatory cells in renal interstitial and the score of renal interstitial fibrosis was fewer(P＜0.05) and the expression of TGF-β1 was dexreased(P＜0.05).After 7 days of treatment,the expreesion of FN in renal interstitium of UUO rats was decreased(P＜0.05).After 14 days of treatment,the scores of cell infiltration and chronic lesions in renal interstitium had a decline of 22.2%and 19.1%than UUO group(P＜0.05),while the expression of TGF-β1 and FN was decreased 30.8%and 30%than UUO group(P＜0.05).ConclusionNiaoduqing prevent renal disease progression in early stage by downregulating the expression of TGF-β1 and FN,and inhibit infiltration of inflammatory cell，transdifferentiation of renal tubule cell，extraeellular matrix accumulation and interstitial fibrosis.

Niaoduqing granule;renal interstitial fibrosis;TGF-β1;unilateral ureteral obstruction

R285.5;R692

A

2016-06-09

广东省中医药局资助项目(20131272)。

陈琇萌，女，副主任医师，研究方向：慢性肾脏病诊治。

*俞小敏，女，主任医师，E-mail:yxm.s@126.com。