川贝母的研究进展

张志勇， 杨 洁， 齐泽民

(内江师范学院生命科学学院/四川省高等学校特色农业资源研究与利用重点实验室，四川内江 641112)

川贝母(FritillariacirrhosaD.Don)为百合科贝母属(FritillariaL.)多种植物的干燥鳞茎，为我国传统可用于保健食品的名贵中药材，有清热润肺、化痰止咳、散结消痈之功效。2015版《中华人民共和国药典(一部)》收载的川贝母基原种为川贝母、暗紫贝母(F.unibracteataHsiao et K. C. Hsia)、甘肃贝母(F.przewalskiiMaxim)、梭砂贝母(F.delavayiFranch)、太白贝母(F.taipaiensisP.Y.Li)或瓦布贝母[F.unibracteataHsiao et K. C. Hsia var.wabuensis(S. Y. Tang et S. C. Yue) Z. D. Liu，S. Wang et S. C. Chen]，按性状不同分别习称松贝、青贝、炉贝和栽培品[1-3]。川贝母主产于四川甘孜州、阿坝州及青海、甘肃和西藏交界地区，生长在山坡草丛或阴湿的小灌木丛中。川贝母由于生境特殊且种子休眠期长、自然萌发率低、野生资源过度采挖等原因而日趋濒危。近年来，关于川贝母的研究进展迅速，在生理生态习性、药用有效成分、药理活性及其作用、种苗繁育与野外抚育、分子生物学研究等方面取得了较大突破，本文就相关方面的研究进行总结，旨在为川贝母的资源保护和合理开发利用提供一定参考。

1 生理生态习性

川贝母主要分布在海拔3 200～4 200 m的川西高原和青藏高原地区，高寒、高海拔是其生境的显著特征。陈士林等根据川贝母分布的群落样地相对优势度，应用聚类分析方法划分川贝母分布的群落类型[4]。通过对暗紫贝母适宜产地的分析发现，其分布区地势具有高亢寒冷、日照强烈、空气干燥、春秋短暂等特性[5]。陈文年等对贝母生长地融雪时间及海拔梯度的研究表明，暗紫贝母鳞茎平均单粒质量随着海拔的升高而降低；暗紫贝母的株高、单叶面积、地上生物量与生长地融雪时间关系密切，融雪时间对川贝母早期和中期物候阶段影响较大，积雪晚融环境更利于川贝母的生长[6-7]。

川贝母种子在自然条件下休眠期长，出苗率低，出苗整齐度不理想，其原因在于种子有后熟过程，包括形态后熟和生理后熟2个阶段，因此需要一定的低温处理，才能完成后熟过程，解除休眠，促进发芽[8]。在对川贝母开花动态及授粉习性的研究中发现，川贝母自然异交率为81.9%，属典型异花授粉植物[9]。在川贝母花期、果期喷施以磷、钾无机元素为主，生长调节剂为辅的复合叶面肥和生长调节剂的复合型叶面肥，有利于提高川贝母的挂果率，从而促进川贝母的种子繁殖与人工栽培[10]。

2 川贝母的化学成分及其药理作用

2.1 川贝母的化学成分

川贝母的主要有效成分为生物碱、皂苷和核苷等，且因其基源植物的不同而存在差异。余世春等利用光谱法在暗紫贝母干燥鳞茎中分离出异甾体生物碱等成分[11]。曹新伟等采用反复硅胶柱色谱法从川贝母的干燥鳞茎中分离纯化出川贝酮、贝母乙素、贝母甲素等8种生物碱[12]。目前，在川贝母中分离并确定结构的生物碱成分有100余个化合物[13]。总体上看，从川贝母中分离得到的生物碱成分主要有西贝素、贝母辛、松贝辛、川贝酮、松贝甲素、松贝乙素等[1]。利用高效液相色谱-蒸发光散射法同时测定瓦布贝母鳞茎中的西贝母碱、贝母辛和贝母素乙等3种主要生物碱发现，瓦布贝母中的生物碱含量高于川贝母其他几个基原种[14]。川贝母的茎、叶中同样含有较高的生物碱类成分，并且野生川贝母茎和叶中的总生物碱含量均高于人工栽培种[15]。

川贝母中的非生物碱类成分也十分丰富，迄今从贝母属分离到的非生物碱类成分有40多种，主要含有萜类、甾体、β-谷甾醇、油酸、硬脂酸、软脂酸、嘌呤、嘧啶等[1，16-18]。王曙等用两相滴定法和质量法测定川贝母和其他贝母药材中总生物碱含量和总皂苷含量发现，川贝母的总生物碱含量较浙贝母、伊贝母低，而总皂苷含量较高，说明不仅生物碱类成分能代表川贝母药效特色，皂苷等其他成分也可以作为优质川贝母的评价指标[19]。而川贝母新基原植物太白贝母中含有的紫外吸收水溶性成分主要是核苷类成分[20-22]。Cao等用HPLC-DAD法测定13种贝母类药材中的核苷类成分含量，结果表明，以尿苷、鸟苷和腺苷为主的9类核苷类成分普遍存在于各种贝母药材中，说明核苷类成分可作为贝母类药材生物碱以外的活性成分[23]。Duan等进一步从川贝母水溶性提取物中定量分析鉴定了10种核苷和核碱基，并首次分离出2-脱氧腺苷和肌苷2种成分[24]。Peng等对不同生长期太白贝母9种核苷类成分的定量分析发现，尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤和肌苷在2～4年生太白贝母中的含量显著高于5～6年生，而胞苷、尿苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和腺苷的含量保持稳定[25]。川贝母有效成分的差异可能源于内生真菌的不同。通过比较不同生长期川贝母的内生真菌发现，在类别和数量上存在着显著差异，以3年生川贝母内生真菌种类和数量最多[26]。内生真菌能产生生理活性成分，如瓦布贝母的内生真菌芬芳镰刀菌6WBY3能产生贝母辛和西贝素-3β-D-葡萄糖苷[27]。

对同一产地不同川贝母基原植物中生物碱提取物的定性和定量分析表明，不同商品名称的川贝母虽然成分上存在差异，但整体的化学成分组成相似、药效也相近，可作为同一药材使用[28]。

2.2 川贝母药理作用

2.2.1 镇咳祛痰作用 川贝母为传统的止咳化痰良药。李萍等对暗紫贝母等11种商品贝母进行的镇咳药理试验表明，贝母的生物碱部分对小鼠氨水引咳有显著的镇咳作用[29]。孙涛等在研究川贝母止咳颗粒药理作用的过程中发现，川贝母止咳颗粒对于动物模型的咳嗽潜伏期和降低咳嗽次数有不同程度的影响[30]。

黏稠的痰会造成呼吸道阻塞而感染，并刺激呼吸道引起咳嗽，川贝母可降低痰液黏稠度，同时对平滑肌有松弛作用，且川贝母中较高含量的皂苷可使小鼠呼吸道中的酚红分泌物显著增加，表明川贝母中皂苷可以成为祛痰的有效成分[29，31]。进一步研究表明，川贝母中的西贝素、西贝素β-氮氧化物、异浙贝甲素、异浙贝甲素β-氮氧化物等4种生物碱是镇咳、化痰、消炎的主要有效成分[32-33]。周宜等通过分析不同基源川贝母品种的祛痰作用发现，暗紫贝母和梭砂贝母的止咳祛痰功效均优于甘肃贝母[31]。川贝母新资源太白贝母同样有明显的止咳、祛痰作用，其效果与川贝母无明显差异[34]。

2.2.2 平喘作用 哮喘是由于过敏原或其他非过敏因素引起的气管和支气管对各种刺激的反应性增高而导致广泛、可逆的气道狭窄[13]，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，川贝母是防治复发性哮喘的首选中药[35]。川贝母通过抑制Th2细胞因子、免疫球蛋白E和组胺的产生，减少嗜酸性粒细胞的积累、提高干扰素-γ的产生，从而起到平喘的作用[36]。进一步研究发现，瓦布贝母、浓密贝母以及商品名为松贝等3种贝母均可以缓解反复接触过敏原所引起的过敏性哮喘症状，发挥平喘的作用[37]。杨仕军等对川贝母防治小鼠复发哮喘疗效的研究结果表明，6种川贝母在相应的作用环节上各有特色，其中暗紫贝母的总体效果最佳[35]。

2.2.3 抗癌作用 近来的研究表明，川贝母对治疗子宫内膜癌、卵巢癌等女性癌症有良好的效果。川贝母的提取物能够抑制子宫内膜癌转化生长因子TGF-β的信号传导通路，从而抑制癌细胞的增殖[38]。同时，川贝母提取物能够靶向NFKB基因，抑制卵巢癌、子宫内膜癌细胞的增殖[39]。

2.2.4 抗菌消炎作用 川贝母醇提取物对格兰氏阳性的葡萄球菌和格兰氏阴性的卡它球菌具有抑制作用[40]。川贝母总生物碱提取液对金黄色葡萄球菌及粪肠球菌均有较明显的抑制效果[41]。川贝母也具有良好的消炎作用，不同剂量的川贝母止嗽颗粒对急性炎症及亚急性炎症具有较好的抑制作用[42]。进一步研究表明，贝母中的西贝素和浙贝乙素能阻断促炎介质如NO的产生[43]。

此外，因含有多种生物活性成分，川贝母还具有镇静、镇痛、抗血小板凝集、抗溃疡、抗缺氧和抗疲劳等功能，并且可以减轻脂质过氧化和清除氧自由基，具有明显的养生保健功效[1，35，44]。

3 种苗繁育

3.1 人工栽培

前人在川贝母人工育苗方面做了大量研究，但种子休眠周期长、发芽率低、出苗整齐度不理想等因素对种苗的繁育有较大阻碍。研究表明，川贝母种子休眠主要原因在于形态后熟和发芽抑制物的存在，是典型的混合型休眠，采用20～40 mg/kg 赤霉素对川贝母种子预处理32 h，能促进种子萌发，有效提高川贝母的出苗率和种苗整齐度[45]。通过层积处理也可打破种子休眠，其中25 ℃是发芽的适温[8]。

Wu等对川贝母种子的含水量、吸水量和发芽率进行测定，并鉴定了川贝母种子的分级标准[46]。陈士林等根据川贝母的群落生态特征，在海拔4 000 m以上的原生地进行野生抚育研究，建立了野生抚育基地，促进了川贝母人工栽培的试验和推广[47]。川贝母经腐殖土保湿储藏促进种子后熟后的发芽率达83.6%，利用大棚设施栽培可以延长川贝母的生育期[48]。Hu等分别用川贝母种子和1年生鳞茎进行播种繁殖，结果表明，使用添加昆虫粪便的腐殖质进行种子繁殖效果更佳，而有无添加物均能促进1年生鳞茎的萌发和生长[49]。

3.2 组织培养

川贝母种子育苗周期长，难以满足市场对贝母的需求。组织培养快速繁殖种苗不受季节限制，增殖系数高，因此研究人员在川贝母组织培养方面也进行了尝试[50]。

3.2.1 外植体 川贝母组织培养选用的外植体一般用的是幼小鳞茎，另外川贝母叶和种子也可作为外植体。王跃华等分别以川贝母种子萌发出的针形幼苗、叶片、茎段和鳞片为外植体诱导愈伤组织，其中鳞片的诱导率最高[51]。李隆云等以不同生长发育期的暗紫贝母鳞茎为外置体诱导愈伤组织，其中1匹叶时期效果最佳，表明愈伤组织的诱导能力与外植体的生长发育时间密切相关[52]。以多倍体川贝母鳞茎芽为外植体诱导不定根，在35 ℃预脱毒处理后，选取生长状况好的不定根切取其生长点区域进行培养，不仅愈伤组织诱导率高，而且脱毒效果好[53]。

3.2.2 培养条件 选择合适的培养基是组织培养成功的关键，因品种不同、外植体来源不同，选用的培养基也有所区别。王跃华等以卷叶贝母鳞茎愈伤组织的增殖量来比较MS、B5、White和SH等4种培养基的影响效果发现，MS基本培养基的愈伤组织增殖率最高，SH培养基的增殖率最低[54]。除基本培养基之外，外源激素[55]、蔗糖浓度[56]、温度和光照等[54，57-58]培养条件也均对川贝母的生长有影响。

组织培养得到的鳞茎经生药鉴定，其药理成分并未发生改变，且生物碱的含量较野生贝母资源高，说明利用组培技术对川贝母进行无性繁殖是切实可行的[59-61]。尽管如此，川贝母组织培养中仍存在一些亟待解决的问题，如川贝母鳞茎及种子均存在休眠现象，进行组织培养时须要首先采用物理或化学等方法破除休眠，易导致外植体材料发生褐化，此外使用鳞茎繁殖会消耗部分商品鳞茎。此外，川贝母的年生育期短，须要严格掌握好再生植株的驯化移栽时间，否则会影响植株的成活及鳞茎的发育。

4 川贝母分子生物学研究

4.1 分类鉴定

贝母属植物种类繁多，根据中药贝母基原植物划分为川贝母、伊贝母、浙贝母、湖北贝母、平贝母和皖贝母等6个类型，川贝母是药用价值最高的类群[62]。不同类型贝母从外观上不易区分，但质量和药用价值差异明显，因此市场上常出现以次充好的现象。从分子水平进行分类鉴定和遗传多样性分析，可以准确区分川贝母及其混伪品。

徐传林等采用PCR-RFLP分子鉴定法研究发现，川贝母核糖体DNA的ITS1区存在的特异性酶切位点，经SmaⅠ酶切后有2条清晰的酶切条带，而非川贝类均不能被酶切，该方法可简便快速地对川贝母进行鉴定[63]。将PCR和RFLP技术相结合，目前已开发出适于川贝母快速检测的DNA试剂盒，其鉴定结果与药典法[64]完全一致。

利用PCR技术可以有效区分川贝母及其混伪品。Lee等设计特异引物进行热不对称PCR扩增，通过对5S rRNA间隔区域 16-mer特异序列的检测，可以有效区分川贝母和浙贝母[65]。Li等通过设计引物扩增7种贝母的5S rRNA间隔区序列发现，在川贝母中能扩增出特异片段[66]。谭莹等利用PCR对川贝母及其混伪品5S rDNA序列进行扩增，筛选出川贝母的特异性DNA指纹可作为川贝母及其混伪品快捷可靠的鉴定方法[67]。罗焜等利用DNA条形码技术对10个川贝母不同基原植物及其常见混伪品的ITS2序列进行PCR扩增和测序，结果表明，川贝母及其混伪品的ITS2二级结构存在明显差异，聚类分析发现，川贝母不同基原物种聚为一支可以有效区分混伪品，为川贝母分类鉴定提供新的手段[68]。

4.2 基因克隆

川贝母是传统的名贵药食两用中药材，其有效成分主要是生物碱、皂苷等次生代谢物质，且这些次生代谢物质的合成途径十分复杂。对川贝母基因组序列以及信号传导途径、次生代谢产物合成途径中的关键酶基因进行克隆和分析，有利于阐明川贝母有效成分合成的分子机制，为天然活性物质的人工合成奠定基础。

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，简称HMGR)是通过甲羟戊酸途径合成生物碱的第1个限速酶，也是萜类化合物代谢的重要调控位点。谢紫莹以暗紫贝母新鲜鳞茎为材料，利用RT-PCR获得HMGR基因部分的特异性片段[69]。GF14蛋白是广泛存在于植物中的参与细胞信号传递的调节蛋白，李玉峰采用RT-PCR结合cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends，简称RACE)技术克隆获得 1 133 bp 的GF14蛋白基因序列，分析表明，川贝母的氨基酸序列中有与其他GF14蛋白相似的酶活性位点[70]。通过单分子实时DNA测序(SMRT DNA sequencing)技术，Li等获得了瓦布贝母的叶绿体基因组全序列，为贝母属进化及分子鉴定的研究提供了重要资源[71]。

5 结语

川贝母药用价值极高，但由于较长时期保护和发展的缺乏，以及生境的特殊，生态环境的破坏，导致近年来野生资源数量锐减。因川贝母的混伪品较多，其产业和市场仍然比较混乱。尽管研究者对川贝母的分类鉴定、药用有效成分合成途径等作了不少探索，但分子生物学等前沿性基础研究在整体上仍相对滞后。今后应在加强种质资源保护的同时积极推进行业标准的贯彻落实，加大组织培养技术的攻关力度，打破川贝母的种子休眠，缩短培养周期，不断完善野生抚育和人工栽培技术体系，实现川贝母的工厂化育苗与规模化生产，以此解决川贝母资源短缺问题。此外，可通过加强川贝母的基础研究工作，发掘优良基因资源，加强分子育种技术研究，为川贝母产业发展探求新的道路。

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