永州山银花中绿原酸提取工艺研究及含量测定

2017-02-05张卫军

湖南科技学院学报 2017年10期

张卫军　陈　建

张卫军陈建

（湖南科技学院化学与生物工程学院，湖南永州 425199）

论文以永州山银花为原料，以山银花中绿原酸的含量为考察指标，采用乙醇回流提取法和紫外可见分光光度法，通过单因素试验研究了乙醇体积分数、浸提时间、浸提温度、料液比对山银花中绿原酸浸提量的影响。利用正交试验优化选择，以主要影响因素做正交试验。通过方差分析得到最佳提取工艺为：料液比1：20，乙醇体积分数70%，浸提温度70℃，提取时间120 min。在此条件下绿原酸提取得率为2.86%。此法简单可行，经济适用且环保，适于工业化大生产。

永州山银花；绿原酸；提取工艺

1　引　言

山银花为忍冬科植物红腺忍冬、灰毡毛忍冬、华南忍冬或黄褐毛忍冬的干燥花蕾或初开的花[1]，具有清热解毒、护肝明目、抗菌、降压、免疫调节等功效[2]。山银花的主要有效成分是有机酸类、黄酮类化合物及皂苷，其中绿原酸是山银花的主要药效活性成分之一[3]。绿原酸还是食品、药品、化妆品等工业的重要原料[4-5]。近来研究表明绿原酸还具有抗白血病的作用[6]。因此，开发绿原酸市场前景广阔、发展潜力巨大。

天然药物之所以具有重要药用价值，其原因在于其所含的有效成分具有生物活性[7]。据中药特点，有效成分不仅是药用植物的药效基础，也是评价中药质量的有效指标。大量研究表明：中药材所含化学成分复杂多样，有效成分的含量受地理气候因素影响较大[8-10]。绿原酸是山银花中的重要活性成分之一，其含量也应受气候，温度，地域等条件的影响。因此，对不同地域、不同气候、不同土壤环境下的山银花中绿原酸成分含量展开研究，对于“南北金银花”之争及山银花质量全面控制和科学评价具有重要现实意义。

永州气候宜人，土壤肥沃，野生山银花资源丰富，但山银花研究文献报道却是空白。为扩大中药的药源途径，有必要对湖南永州地区的山银花进行提取工艺研究及含量测定，为进一步开发湖南地区山银花产业提供参考和依据。

2　材料、试剂及仪器

2.1实验材料

实验原料为永州地区山银花，课题组于2016年4-5月分2次采摘，样品采后及时阴干并放入45℃干燥箱中干燥，经粉碎、过60目试样筛，密封室温保存备用。

2.2主要仪器

AUY-120电子分析天平，购自日本岛津公司；752型紫外可见分光光度计，购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司；A-88型组织捣碎均匀机，购自金坊市医疗仪器厂；FW177型中草药粉碎机和WG-20型电热鼓风干燥箱，均购自天津市泰斯特仪器有限公司；RE-201D型电热恒温水浴锅，购自长沙太康科技有限公司。

2.3主要试剂

绿原酸标准品（国药集团化学试剂有限公司）；无水乙醇为分析纯，实验所用的50%、70%、90%浓度的乙醇溶液均由此分析纯稀释而来。

3　方法与实验

3.1对照品标准溶液的配制

取绿原酸对照品5.1 mg，精密称定，置于50 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶液并定容至50 mL，摇匀得102 μg/mL的绿原酸对照品溶液，制作标准曲线。在实验过程中，发现此溶液浓度过大，因此取15 mL浓度为102 μg/mL的绿原酸对照品溶液于50 mL容量瓶中，配制成浓度为30.6 μg/mL的对照品溶液。放入冰箱（4℃）待用。

3.2检测波长的选择

通过相关参考文献及实验确定最大吸收波长为328.8 nm。

3.3标准曲线绘制

用5 mL移液管精密量取对照品溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，分别置于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶液定容，摇匀，静置。其浓度分别为0μg/mL、1.224μg/mL、2.448μg/mL、3.67μg/mL、4.896μg/mL、6.120μg/mL、7.464μg/mL。在328.8 nm波长处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，浓度C（μg/mL）为横坐标，绘制绿原酸的标准曲线（如图1）。求得线性回归方程为y＝0.0842x+0.0206，相关系数R2＝0.9998。

图1. 绿原酸的标准曲线

3.4样品中绿原酸提取及含量测定

取山银花粉末0.2 g，精密称定，置于提取器中，加一定料液比的乙醇溶液，加热回流一定时间，提取完成后冷却至室温，用抽滤机两次抽虑合并滤液。将滤液即提取液转移至25 mL容量瓶中，用相应浓度的乙醇溶液定容至刻度线。用移液管移取1mL放置于另一个25 mL容量瓶中，用相应浓度的乙醇溶液定容至刻度线。用紫外分光光度计测得其吸光度，测三组，取其平均值。按照标准曲线算出其浓度。

测得吸光度A，由标准曲线可得浓度C（mg/L）

4　结果与分析

4.1单因素实验结果与分析

4.1.1乙醇体积分数对山银花绿原酸提取得率的影响。准确称取0.2克/份的山银花样品四份，料液比为1∶20。选取提取溶剂分别为50%、60%、70%、90%乙醇溶液，提取温度为70℃，提取时间为2小时。按３.4方法操作，实验结果如图2。

图2. 乙醇体积分数对山银花中绿原酸提取得率的影响

由图2可知，乙醇体积分数在70%之前绿原酸提取得率呈上升趋势，当乙醇体积分数达到70%时达到最大值，之后呈下降趋势，且下降趋势大，是因为随着浓度增加，醇溶性物质竞争溶解，使山银花中绿原酸成分溶解度下降，导致了提取率下降。因此，当乙醇体积分数为70 %时山银花中绿原酸的提取效果最好。

4.1.2料液比对山银花绿原酸提取得得率的影响。准确称取0.2克/份的山银花样品四份，分别加入液料比为1:10、1:15、1:20、1:25（g/mL）。提取溶剂为70%的乙醇溶液，提取温度为70℃，提取时间为2小时。按3.4方法操作，实验结果如图3。

图3. 料液比对山银花中绿原酸提取得率的影响

由图3可以看出，绿原酸提取率随着料液比的不断增大而变大，当料液比达到1：20后，绿原酸的提取率的增幅变化不大，且有下降趋势并开始下降。可能是因为乙醇含量增高，其他物质的提取率也随着增高了，从而影响了绿原酸的提取。所以适宜的料液比为1：20左右。

4.1.3提取时间对绿原酸提取率的影响。准确称取0.2克/份的山银花样品四份，提取溶剂为70%的乙醇溶液，液料比为1:20，提取温度为70℃，提取时间为分别为1小时、1.5小时、2小时、2.5小时。按3.4方法操作。实验结果如图4。

图4. 提取时间对山银花中绿原酸提取率的影响

由图4可以看出，提取时间在1.5-2.0小时之间绿原酸提取率好。2小时前随着提取时间的增加提取率的增幅也不大，2小时后略有降低，可能是随着时间的增加，山银花中的其它成分或杂质浸入提取液中，导致绿原酸的提取率略有降低。考虑经济因素，最宜的提取时间选2小时。

4.1.4温度对绿原酸提取率的影响。准确称取0.2克/份的山银花样品四份，分别于65℃、70℃、75℃、80℃条件下提取，提取溶剂为70%的乙醇溶液，液料比为1:20，提取时间为2小时。按3.4方法操作，实验结果如图5所示。

图5. 提取温度对山银花中绿原酸提取率的影响

由图5可以看出，随着提取温度的增加，提取率先升后降，当温度达到70℃时提取率最高，在70℃前上升的幅度较小，超过70℃后提取率下降幅度较大，原因可能是温度升高使绿原酸成份受热被破坏，导致提取率在一定程度上下降。另外，温度的升高乙醇的挥发会越来越剧烈，乙醇的消耗会增加，不利于实验，根据实验数据，选择最宜的提取温度为70℃。

4.2正交试验结果及分析

4.2.1正交试验结果。在绿原酸的提取过程中，乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度等因素都影响绿原酸的提取得率。根据绿原酸的结构性质及单因素实验的结果和传统的提取经验，选择乙醇体积分数（A）、提取温度(B)、提取时间(C) 3个因素，以绿原酸得率为指标，采用L9（34）设计进行正交试验，其因素水平表和正交实验结果分别见表1、表2。

表1. 正交分析表

所在列ABC 因素提取时间提取温度乙醇体积分数实验结果(%) 实验11(1h)1(65℃)1(50%)2.50 实验22(1.5)2(70℃）1(50%)2.69 实验33(2h)3(75℃)1(50%)2.57 实验42(1.5h)1(65℃)2(70%)2.64 实验53(2h)2(70℃）2(70%)2.86 实验61(1h)3(75℃)2(70%)2.70 实验73(2h)1(65℃)3(90%)2.84 实验81(1)2(70℃）3(90%)2.80 实验92(1.5h)3(75℃)3(90%)2.82 k12.5872.6602.667 k22.7332.7832.717 k32.8202.6972.757 R0.2330.1230.090

表2 . 二次回归方程模型的方差分析表

由表1可以得出各个因素的对绿原酸提取率的影响顺序为RA>RB>RC，预测最佳组合为A3B2C2；从表2方差分析数据可知提取时间，提取温度为重要因素，乙醇体积分数为次要影响，故在工业化生产中因将提取时间和提取温度作为关键因素考虑。

4.2.2结果验证试验。为了验证正交设计选取出来的最佳工艺路线的可靠性，以最佳提取条件A3B2C2做三组平行试验，山银银花以1:20的料液比加入70%乙醇溶液，温度为70℃的条件下单次，提取2小时，实验结果如表3。第一次验证试验所得到的结果为2.84%，第二次验证试验所得到的结果为2.79%，第三次验证试验所得到的结果为2.81%。由数据所得三组试验的结果相差不大，故最佳的工艺路线为A3B2C2。

表3. 最优组合条件下的结果验证

试验号提取率平均值RSD 12.84% 22.79%2.81%0.89% 32.81%

5　结　论

以永州产野生山银花为原料，乙醇水溶液为提取剂，经单因素实验正交试验得出绿原酸提取最优条件：乙醇体积分数为70%，提取温度为70℃，提取时间2小时，料液比1:20。在此条件下的最优提取得率为2.86%，符合国家药典规定药用金银花中绿原酸最低质量分数1.5%的要求。文章提供永州产山银花化学活性成分——绿原酸含量等基础资料，为揭示永州山银花绿原酸含量及品质与地理气候因素之间的关系，为山银花产地溯源提供参考依据。

乙醇回流提取山银花中的绿原酸是一种比较高效率的提取方法，操作简单、条件温和，节约成本、耗时短，能够满足工厂的大规模生产。

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（责任编校：宫彦军）