原烟复烤前后细菌种群变化研究

叶建斌，闫 记，刘向真，杨宗灿，申洪涛，刘茂林，杨雪鹏，王根发，彭玉富，卢昶彤

（1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450001；2.河南中烟工业有限责任公司技术中心，河南郑州450000）

原烟复烤前后细菌种群变化研究

叶建斌1，闫 记1，刘向真2*，杨宗灿2，申洪涛2，刘茂林2，杨雪鹏1，王根发2，彭玉富2，卢昶彤2

（1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450001；2.河南中烟工业有限责任公司技术中心，河南郑州450000）

为明确原烟复烤前后表面细菌种群变化情况及其对烟叶发酵的影响，考察了3种不同烟叶（自然状态下的原烟、施加微生物的原烟、复烤后片烟）经发酵后微生物及化学成分的变化情况。不同烟叶发酵1个月后，利用变性梯度凝胶电泳（DGGE）方法研究表面细菌的变化情况，并采用连续流动分析法检测化学成分的变化规律。结果表明：与原烟相比，复烤后烟叶表面的细菌发生明显变化，其中降解蛋白质菌（Bacillus cereus）、降解淀粉菌（Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis）、产香菌（Erwinia、Pantoeadispersa）等细菌的数量均明显低于复烤前的原烟。发酵后，原烟表面富集上述几类细菌，而复烤后烟叶表面细菌则未得到明显富集，部分细菌已检测不到。烟叶发酵1个月后，淀粉、蛋白质、氮含量均降低，还原糖含量显著增加，且原烟的化学成分变化幅度显著高于复烤后烟叶。表明复烤工艺可造成烟叶表面细菌种类和数量减少，由此影响烟叶发酵过程。

原烟；发酵；细菌群落；细菌种群；化学成分

初烤后的原烟经打叶复烤工艺后进入醇化阶段，而醇化一般需要2～3 a的时间。截止目前，普遍认为烟叶醇化是复杂化学转化及微生物促进转化协同作用的过程［1-2］。醇化前，利用烟叶表面微生物对烟叶进行发酵可有效改善烟叶香味品质，适宜的发酵工艺对烟叶品质的提升具有重要意义。

微生物在烟叶发酵过程中占有重要地位。烟叶表面微生物或其产生的酶可降解烟叶中淀粉、蛋白质、木质素等大分子物质，并形成对应的致香前体物或致香化合物，从而有效改善烟叶品质［3］。已有文献报道，烟叶表面存在一些优势微生物，并在烟叶发酵过程中发挥一定作用［4-7］。在此基础上，研究人员从烟叶表面分离到了部分优势微生物并用于提升烟叶质量［7-11］。

传统的烟叶发酵研究以复烤后的片烟为对象，忽视了复烤工艺对原烟表面微生态环境的破坏及对后续发酵过程的影响，可能是导致烤烟发酵时间较长、品质提升较慢的一个重要因素。烟叶复烤包含复杂的处理工艺，其中高温高湿处理、剧烈的物理剪切等都可能使表面微生物失活或破坏微生物群落结构，从而影响后续的发酵进程。因此，有必要考察复烤前后烟叶表面微生物的差异及其导致的发酵后烟叶质量差异。目前，关于发酵后原烟与烤后烟叶间的差异研究尚未见有文献报道。据此，以复烤前后烟叶为对象，考察不同烟叶表面细菌种群的差异，并对比发酵后烟叶化学成分变化的差异，旨在阐明复烤工艺对原烟表面微生物种群和结构的影响及其对后续烟叶发酵的影响，为利用微生物建立合适的原烟发酵工艺提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料、试剂与仪器

供试烟叶来自3个不同产地：河南襄县B3F、云南临沧B3F、云南文山C3F，烟叶年份为2014年，全部为初烤后的原烟，试验前保存于4℃冰箱内。

试剂主要有乙醇、乙酸、色谱甲醇、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、琼脂糖、牛血清蛋白溶液（BSA）、DNA Marker（Takara）、丙稀酰胺、双丙稀酰胺、尿素、Tris（Promega）、EDTA（Promega）、GelRed染料（Biotium），以及各种烟叶化学成分测定所需的化学试剂（采用连续流动分析仪，所需化学试剂参考YC/T 161—2002、YC/T 246—2008、YC/T 216—2007、YC/T 159—2002、YC/T249—2008准备）。

主要仪器：变性梯度凝胶电泳仪以及琼脂糖凝胶电泳仪（Bio-Red）、连续流动分析仪、气相色谱仪、PCR仪、凝胶成像仪、超纯水仪，其他仪器参考YC/T 161—2002、YC/T 246—2008、YC/T 216—2007、YC/T 159—2002、YC/T 249—2008准备。

1.2 方法

1.2.1 原烟发酵过程 每个样品各取2 400 g原烟，平均分成4个部分：一部分直接进入恒温恒湿控制箱（自然状态下的原烟，记为Raw）；一部分经过70℃高温处理15 m in后，采用模拟复烤方式去梗后打成片烟，然后进入恒温恒湿控制箱（打叶复烤后片烟，记为Redry）；另一部分施加实验室前期从烟叶表面分离获得的微生物［包括巨大芽孢杆菌（降解淀粉）、短小芽孢杆菌（降解蛋白质）及厄文氏菌（Erwinia，产香）］，将微生物于50 m L的培养基中进行培养后，离心去掉上清液，用无菌水洗净培养基，并将3种微生物按照质量1∶1∶1混合后重新溶解于50 m L的无菌水中，并以烟叶质量的10%施加到烟叶表面，然后进入恒温恒湿控制箱（施加微生物的原烟，记为M icro）；剩余部分作为空白对照（记为CK）直接放入4℃冰箱保存。所有烟叶表面都施加无菌去离子水，施加量与施加微生物的体积一样，同时恒温恒湿箱中控制温度37℃、湿度65%条件下进行发酵，30 d后结束发酵过程。发酵结束后取各样品烟叶测定化学成分和表面细菌群落结构。

1.2.2 烟叶表面微生物收集 取20 g烟叶置于灭菌的摇瓶中，加入200 m L磷酸钾缓冲液（pH值7.0，0.02 mol/L），在30℃的摇床上以200 r/min的转速摇匀30 min，用双层纱布过滤掉烟叶，收集滤液，滤液在6 000 r/m in下离心30 min，倒掉上清保留沉淀。烟叶表面微生物包含在沉淀当中，收集好沉淀后用于基因组DNA的提取。

1.2.3 微生物种群结构鉴定 烟叶表面微生物全基因组DNA的提取采用Fast DNA Spin kit for soil（MP Biomedicals，Santa Ana，CA），依照说明书优化后操作，获得全基因组DNA，取其中的10μL进行琼脂糖凝胶电泳，剩余保存于-20℃。

以微生物的全基因组DNA为模板，采用微生物的16S rDNA可变区V3的通用引物进行PCR扩增，所采用的通用引物为341F（5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和518R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′），其中341F的5′端带有GC发夹结构（5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3′）。采用降落PCR进行扩增（touch down PCR）：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，65～56℃下30 s（每个循环降1℃，共10个循环），72℃延伸1 min，后20个循环用55℃退火30 s，最后72℃下延伸10 min。结束后进行复原条件PCR（reconditioning PCR）去除引物二聚体；以此次2.5μL PCR产物为模板，以相同的反应体系和反应条件再次进行PCR扩增，把循环数减少到3个循环。

采用Bio-Rad电泳装置，将扩增获得的PCR产物进行变性梯度凝胶电泳（DGGE）。电泳胶采用8%的聚丙稀酰胺凝胶，并制成40%～60%的梯度变性胶（100%变性剂为7 mol/L尿素和40%去离子甲酰胺的混合物），电泳液为0.5×TAE电泳缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，pH值8.3，10 mmol/L醋酸，0.5 mmol/L EDTA），样品在60℃、75 V电压下电泳16 h。电泳结束后用Gelred染色，再用凝胶成像仪拍照。

1.2.4 微生物分子鉴定 从DGGE胶上割下具有代表性的条带，置于EP管中，然后加入30μL灭菌去离子水，于4℃下放置过夜，使DNA慢慢溶解出来。取2μL该DNA溶液，进行PCR扩增。PCR引物仍为518R和341F，但341F的5′端不带GC发夹结构，反应条件为：94℃变性1 min，30个循环的扩增（94℃30 s，50℃30 s，72℃2 min），最后72℃延伸7 min。PCR产物进行电泳验证，直到所有目的条带都扩增成功，送往测序公司进行测序。测序获得的序列与NCBI（http：//www.ncbi.Dlin.nih.gov/ blastA）上的数据库进行比对，找出进化关系最近的物种，并采用邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建进化树。

1.2.5 烟叶化学成分测定 对3个不同产地来源各4组处理方式的烟叶进行了化学成分测定，具体包括总氮、烟碱、淀粉、水溶性糖和还原糖、蛋白质含量。具体测定方法分别依照YC/T 161—2002、YC/ T 246—2008、YC/T 216—2013、YC/T 159—2002、YC/T 249—2008进行操作。

2 结果与分析

2.1 不同处理烟叶表面微生物种群含量

提取发酵30 d后4组烟叶表面的微生物总DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，所获得DNA片段大于2 000 bp（图1）。从图1可以看出，4组不同烟叶中，复烤后烟叶（Redry）表面微生物含量最少，甚至少于CK，初步表明原烟经打叶复烤后表面微生物有所减少，这可能与打叶复烤工艺造成的微生物失活有所关联。原烟表面微生物在经过一段时间的发酵后有所增加，其中施加微生物的原烟表面微生物含量增加最多，自然状态下原烟次之，经发酵后复烤烟叶表面微生物量仍少于原烟。不同产地烟叶表面微生物含量有所差异，云南文山C3F原烟表面微生物含量略多于云南临沧B3F，而河南襄县B3F原烟表面的微生物含量则相对较少。

2.2 不同处理烟叶表面微生物种群分析

为确定烟叶表面微生物种群数量的变化情况，利用通用引物扩增16S rDNA，扩增后的片段在200 bp左右（图2），将PCR扩增后的产物进行DGGE电泳，结果如图3，每个泳道中条带数量可以代表其中的微

生物种类数量，而亮度可代表微生物的含量。由图3可知，与CK相比，复烤后烟叶表面微生物种类有所减少，部分微生物甚至无法检测到。如河南襄县B3F烟叶，条带3、4在复烤后烟叶表面均未检测到；云南文山C3F烟叶中多个条带在复烤烟叶表面亮度较低，表明其微生物含量低。因此，部分微生物在经过高温处理后已经失活，在发酵过程中难以得到有效富集。相反，原烟经过一段时间发酵后表面部分微生物得到富集，3个不同产地的自然状态下的原烟（Raw）与对应产地的CK相比，部分条带亮度明显加强，暗示对应微生物含量增加。如河南襄县B3F的条带1、3、4；云南临沧B3F的条带5、6、10；云南文山C3F的条带11、13、15。施加微生物的原烟表面微生物富集更多，其DNA条带数量比同一产地的其他烟叶要多，部分条带亮度也更强，暗示种群数量和微生物含量均有所增加。结果显示，原烟表面所携带的微生物在发酵过程中得到有效富集，而经复烤后的烟叶表面部分微生物失活，在发酵过程中难以富集。

2.3 不同处理烟叶表面微生物种类变化规律

为了进一步确定这些烟叶表面微生物种类的变化情况，将图3中变化较为明显的条带（1—16及S1、S2、S3）进行割胶后测序，将序列与GenBank中已有数据库进行比对，寻找最为相近的微生物种群，并构建进化树（图4）。

与报道文献［12-18］相比，这些在烟叶表面具有明显差异的细菌根据功能不同可分为产香、降解淀粉、降解蛋白质及降解烟碱4类细菌以及部分不可培养的细菌。经测序，条带1、4、5、9、15与之前在烟叶表面发现的产香微生物厄文氏菌（Erwinia）以及泛菌属（Pantoea dispersa）在分子进化上类似，其中厄文氏菌是一类降解类胡萝卜素生成香味物质的重要微生物［12］，而泛菌属微生物也已被报道可降解类胡萝卜素生成烟草中重要香味物质［13］。条带3和6与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）在分子进化上接近；条带7和11与解淀粉类芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）类似，这2类微生物已被证实属于可降解淀粉的微生物［14-15］。条带2、8、14、16与蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）类似，是一类被广泛证实可降解蛋白质的微生物［16］。另外，条带S1—S3属于实验室前期从烟叶表面富集分离到的微生物，进化树确定S1为厄文氏菌（产香类细菌），S2为巨大芽孢杆菌（降解烟碱类细菌）［17］，而S3则为短小芽孢杆菌（降解蛋白质类细菌）［18］。除此之外，还发现了一些不可培养的细菌，包括条带10、12、13。结合图3分析，与CK相比，复烤后烟叶表面产香、降解淀粉、降解蛋白质及降解烟碱4类细菌种类和数量减少较为明显，而原烟经发酵后则有所增加。例如Bacillus subtilis（条带3）、Bacillus cereus（条带2）、Pantoea dispersa（条带4）在河南襄县B3F原烟中均有检出，而在复烤后烟叶中却无法检测到，其中原烟发酵后表面微生物含量多于CK，说明其在发酵过程得到了富集；同样在发酵后的云南临沧B3F原烟表面检测到大量Bacillus subtilis（条带6）、Bacillus cereus（条带8）、Erwinia（条带5、9），而这些微生物的含量在复烤后的烟叶表面则明显较少；云南文山C3F呈现出了同样的趋势。外源添加的3类微生物在发酵一段时间后也得到了一定的富集。图3中，条带S1、S2、S3在3个产地的施加微生物原烟（Micro）表面都有检出，并且微生物含量较多。因此推断，这几类分离于烟叶表面的微生物通过合适的外源培养后再施加到烟叶表面，可得到富集。结果证明，复烤前后烟叶表面微生物种类和数量存在较大的差异，这种差异在后续的发酵过程中越发明显，由此可能影响烟叶发酵过程。

2.4 不同处理烟叶的化学成分

为了探讨烟叶表面微生物菌群变化对烟叶发酵过程的影响，利用连续流动法测定了各化学成分含量，包括淀粉、蛋白质、还原糖、烟碱、总氮以及水溶性总糖。表1显示，与CK相比，经发酵后，所有原烟和复烤后片烟的淀粉含量均有所降低，还原糖含量增加。其中，施加微生物的原烟变幅最为显著，其次是自然发酵后的原烟，复烤后片烟变幅最少，这与烟叶表面降解淀粉的微生物含量明显多于复烤后片烟（图3，条带3、6、7、11、S3）表现一致。云南文山C3F原烟施加微生物发酵1个月后淀粉含量降低了20.2%，而还原糖含量增加了11.1%；云南临沧B3F次之，淀粉含量降低18.0%，还原糖含量则增加了11.0%；河南襄县B3F变幅相对较少，淀粉含量降低13.7%，而还原糖含量增加了9.8%。还原糖增加可能与淀粉的降解有一定的关系。与CK相比，经发酵后的烟叶蛋白质和总氮含量均有所降低，且变化量明显。3个产地的烟叶蛋白质降解率均表现为施加微生物的原烟＞自然状态下的原烟＞复烤后的片烟。其中，云南文山C3F施加微生物的原烟蛋白质和氮含量分别降低了17.9%和18.2%；自然状态下的原烟则分别降低了15.4%和13.6%；而复烤后片烟只减少了6.5%和9.1%。原烟表面降解蛋白质类微生物的富集可能会加速烟叶蛋白质和总氮的降解。经发酵1个月后，原烟表面此类微生物（图3，条带2、8、14、16）的富集明显优于复烤后片烟。发酵过程中总糖含量总体上呈减少趋势，但变化规律不明显，部分烟叶经发酵后还有所增加。总糖含量的测定包括了所有还原糖以及其他一些多糖，因此在本研究中无法利用微生物种群的变化来解释，需要后期进一步跟踪检测。

在发酵过程中，烟碱含量也有不同程度的降低，其中复烤后片烟中烟碱含量降低最为明显，而施加微生物的原烟次之，自然状态下的原烟降解最少。推断高温可能是导致烟碱含量减少的主要因素之一，这部分减少的烟碱可能是原烟中游离态的烟碱。复烤前后烟叶化学成分变化的差异证明，对应微生物的种群和结构变化可影响发酵后的烟叶质量。因此，复烤中高温处理工艺对原烟表面微生物的影响是导致烟叶化学成分变化的重要因素。

3 结论与讨论

与原烟相比，复烤后烟叶表面的微生物发生显著变化，降解蛋白质菌（Bacillus cereus）、降解淀粉菌（Bacillus amyloliquefaciens，Bacillus subtilis）、产香菌（Erwinia，Pantoea dispersa）等微生物的数量均明显低于复烤前的原烟。由此可以预期，烟叶经复烤后表面微生物的种群和结构会出现一定的变化。这可能是因为复烤过程中高温高湿工艺条件破坏了烟叶表面的微生物群落结构。本研究利用DGGE手段鉴定了在此过程中变化的微生物种类，特别是对一些降解大分子物质的微生物进行了分子鉴定，为原烟生物发酵提供一定的理论参考价值。

经1个月发酵，上述几类微生物随着发酵的进行可在原烟表面得到富集，而复烤后烟叶表面微生物则未得到明显富集。这些微生物在复烤工艺后可能已经失活，难以重新成为优势菌群。另一方面，复烤后的片烟表面微生物种类已经有所减少，群落结构可能已遭到破坏，新的微生物种群和结构需要一定时间来完成恢复过程。已有文献报道，复烤后片烟表面微生物在陈化过程会出现一定的变化［16］，且随着陈化的进行，表面微生物种类有所减少，但未阐明其中的原因。根据本研究结果推测，原烟表面微生物在经打叶复烤后出现种群及结构上的剧烈变化，进入陈化阶段后，新的微生物群落结构会以烟叶表面的营养物质作为微生物培养基质进行一定的繁殖，同时部分微生物可能难以适应自然醇化下的条件改变而最终失活或消失。

烟叶的化学成分比较验证了上述结论，经发酵后淀粉含量均降低，还原糖含量均显著增加，蛋白质和氮含量均有所降低。其中微生物种类和数量越多的烟叶样品中，这几类化学成分的变化趋势越明显，同一产地的原烟均高于复烤后的烟叶。本研究通过16S rRNA分子鉴定确定了降解淀粉菌、降解蛋白质菌及部分产香菌。这些微生物可以利用对应底物作为生长基质，在发酵过程中得到一定的富集。淀粉、蛋白质等大分子物质本身对于卷烟工业是不利的，因此，通过发酵后其含量减少将可能对烟叶内在品质有一定的改变，后期还将通过更为专业的烟草评吸人员进行感官评吸验证。

本研究结果表明，复烤过程可造成烟叶表面降解大分子物质的微生物种类和数量减少，因此，传统的复烤后片烟发酵工艺并未完全发挥微生物改善烟叶质量的重要作用，后续的烟叶发酵工艺及烟叶质量有待进一步改善。总之，在烟叶发酵过程中，应正确考虑原烟表面微生物对烟叶发酵的影响，为发挥这些微生物作用可考虑在复烤前引入相应的原烟发酵工艺。

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Study on Change of Bacteria Populations of Raw Tobacco Leaves before and after Redrying

YE Jianbin1，YAN Ji1，LIU Xiangzhen2*，YANG Zongcan2，SHEN Hongtao2，LIU Maolin2，YANG Xuepeng1，WANG Genfa2，PENG Yufu2，LU Changtong2
（1.College of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450001，China；2.Technology Center，China Tobacco Henan Industrial Co.，Ltd.，Zhengzhou 450000，China）

In order to study the changing of bacterial populations on the leaf surface of tobacco before and after redrying，three different kinds of tobacco leaves were investigated，including raw tobacco leaves，raw tobacco leaves adding microbes and flue-cured tobacco leaves.After fermentation for one month，the change of bacterial populations on the leaf surface of tobacco were studied by DGGE（denaturing gel gradient electrophoresis），the change of chemical compositions of tobacco leaves were detected by the continuous flow method.The results showed that the bacterial populations on the leaf surface of tobacco changed largely after redrying.The numbers of protein degrading bacteria（Bacillus cereus），starch degrading bacteria（Bacillus amyloliquefaciens，Bacillus subtilis）and aroma producing bacteria（Erwinia，Pantoeadispersa）were obviously lowered after redrying.These kinds of bacteria were increased in raw tobacco leaves after onemonth fermentation，while they almost disappeared in the flue-cured tobacco leaves.For chemical compositions，contents of starch，protein and total nitrogen declined，sugar content increased.Likewise，the change amp litude of these chemical compositions was relatively larger in raw tobacco leaves than that in the flue-cured tobacco leaves.Study here indicated that the redrying process could reduce the bacterial population on the surface of tobacco leaves，which may effect the fermentation process.

raw tobacco；fermentation；bacterial communities；bacteria populations；chemical compositions

Q939.9；TS44+3；TS44+4

A

1004-3268（2017）01-0154-06

2016-07-15

河南中烟科技创新项目（YN2014046）；郑州轻工业学院博士基金项目（BSJJ2014066）

叶建斌（1986-），福建莆田人，讲师，博士，主要从事烟草生物技术、烟草原料学研究。E-mail：happye1986@163.com

*通讯作者：刘向真（1982-），河南濮阳人，工程师，本科，主要从事烟草原料学研究。E-mail：30623504@qq.com