蝴蝶兰丛生芽组织培养研究进展

2017-02-03陈和明吕复兵

广东农业科学 2017年10期

黄丹，陈和明，吕复兵

（广东省农业科学院环境园艺研究所/广东省园林花卉种质创新综合利用重点实验室，广东广州 510640）

蝴蝶兰（Phalaenopsis）为兰科蝴蝶兰属植物，原产于亚热带雨林地区，本性喜暖畏寒，为附生性兰花。其花型似蝶、色彩多样、鲜艳多姿，花序好、花期长，广受花卉爱好者的喜爱，素有“兰花皇后”的美称，在全世界广泛栽培［1］。蝴蝶兰是单茎性气生兰，几乎没有侧芽萌发，不能通过分株方式进行繁殖；同时蝴蝶兰种子不含胚乳，自然条件下萌发率非常低，不能通过播种方式进行繁殖［2］。因此，以上两种繁殖方式均不能满足市场对蝴蝶兰的广泛需求。

目前，蝴蝶兰的繁殖方法主要为无菌播种［3-4］和组织培养无性繁殖［5］，无菌播种主要进行杂交或自交获得种子，经过无菌播种得到实生苗，但实生苗分离大且变异多，不能保持亲本的遗传稳定性，花色、花期多变等；利用茎、根、叶等外植体诱导原球茎进行增殖并分化成苗，虽然性状相对一致，但仍有较高的变异率，如花色不纯等［6］。利用丛生芽进行蝴蝶兰繁殖是一种从芽到芽的增殖途径，其优点是通过芽长芽的方式使亲本的遗传稳定，减少变异的发生，是最有效的快速繁殖方法［7-9］。因此，本文主要针对蝴蝶兰丛生芽组织培养研究进展进行综述，旨在为蝴蝶兰种苗规模化生产提供依据。

1 外植体

1.1 外植体的选取

谭鹏鹏等［10］及尚杨娟等［11］以花梗为外植体，对花梗腋芽进行了试验研究，结果表明：第2节、第3节花梗有较高的萌发率，以第3节萌发率最高；并得出花梗基部的第1～3节诱导营养芽成功率较高，第4和第5节靠近顶端部分成为花芽的几率大，这可能与芽的分化部位有关，花梗基部的芽主要是休眠芽，在生长激素的诱导刺激下容易发育成营养芽，但花序顶端的芽含有未完全分化的花原基，在培养基中比较容易诱导萌发为花芽［12］。刘亮等［8］在蝴蝶兰丛生芽诱导试验中也采用花梗腋芽作为外植体，将第一代诱导出来的新花梗芽作为丛生芽增殖的材料，增殖倍数可达5.5。

1.2 外植体的消毒灭菌

马晓娟等［13］在蝴蝶兰V31品种的花梗组培快繁中发现，消毒时间对花梗腋芽的诱导率、褐化死亡率和污染率都有明显影响，在0.1%氯化汞的条件下，消毒8 min的诱导率比消毒10 min的诱导率高出6.62%，且褐化率明显偏低。付镇芳等［14］在蝴蝶兰大辣椒花梗组织快繁研究中发现，消毒剂、消毒时间对外植体无菌处理至关重要，既要消毒干净外植体，又不能损伤外植体的组织。其中花梗在次氯酸钠消毒过程中，有大量细菌性、真菌性污染出现，当消毒20 min时污染减少，但用升汞消毒时，随着灭菌时间的增加，细菌性、真菌性污染逐渐减少，其中消毒10 min和15 min时最彻底，但消毒10 min的成活率高于15 min。然而，曾德华等［15］在满天红蝴蝶兰花梗组培快繁中，用升汞消毒9～11 min时，细菌性污染出现较多，当消毒13～15 min时，随时间的增加，细菌性污染减少，成功率高达85%以上。

2 丛生芽的诱导

2.1 基本培养基对丛生芽诱导的影响

马晓娟等［13］在蝴蝶兰丛生芽快速繁殖体系中，在1/2MS和MS培养基中，1/2MS的诱导率比MS高出24.94%、褐化率也明显比MS低，而MS培养基褐化严重且发生早，表明1/2MS培养基更有利于外植体的诱导。田甜［16］将蝴蝶兰外植体分别接种在MS、KYOTO、1/2MS 3种培养基中发现，1/2MS培养基萌发率最高。但武爱龙等［17］在蝴蝶兰大辣椒组织培养与快速繁殖的研究中，以花宝一号为基本培养基，诱导丛生芽的最佳配方为：花宝一号+NAA 0.3 mg/L+6-BA 5.0 mg/L。

2.2 6-BA及NAA对丛生芽诱导的影响

李金雨等［18］研究发现，6-BA浓度在0.0～3.0 mg/L之间，随着6-BA浓度的增加，蝴蝶兰丛生芽的诱导率上升，且诱导时间缩短；但6-BA浓度在3.0～7.0 mg/L之间，随着6-BA浓度的上升，其诱导时间逐渐缩短，但诱导率没有明显变化，说明当6-BA浓度在3.0 mg/L以上时，增加6-BA浓度对蝴蝶兰丛生芽诱导率作用不大。因此，3.0 mg/L的6-BA对诱导蝴蝶兰丛生芽是最适宜的。刘亮等［8］认为在不添加NAA的条件下，随着6-BA浓度的增加，诱导率上升且诱导时间缩短，当6-BA 3.0mg/L时，添加少量NAA诱导率达100%，因此6-BA和NAA组合使用效果较好。华海霞［19］也认为NAA对芽的诱导影响不大，而6-BA的影响显著，随着6-BA浓度的上升，增殖系数变大，在6-BA 2.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L下效果最好。但张伟等［20］的试验认为，在相同培养基的条件下，同时使用6-BA、NAA时诱导率比单独使用6-BA时低，且培养时间长；当6-BA的浓度达到5.0 mg/L时，诱导率略有下降且生长较弱，表明高浓度的6-BA不适合蝴蝶兰花梗侧芽的诱导，当单独使用6-BA且浓度在3.0 mg/L时，诱导率最高。

3 丛生芽的增殖

3.1 切割与摆放方式对丛生芽增殖的影响

钟海丰等［21］设置了6种不同的芽体物理切分与摆放方式，研究结果表明：芽体不同切分与摆放方式对蝴蝶兰丛生芽增殖具有显著影响。芽体切除生长点后横插，其单芽平均增殖率显著高于其他处理，其中PSP-3（单芽切除生长点后横插）和PSP-6（双芽切除生长点后横插）的单芽平均诱导芽数分别为6个和5.9个，而常规单芽切除2/3叶片后竖插，其单芽平均诱导芽数仅为3.5个。但芽体损伤和芽体大小方面，不同处理的死亡率有所不同，单芽切除2/3叶片后纵切横插的死亡率最高、达33.3%，单芽切除生长点后横插的死亡率次之、为23.3%。

3.2 基本培养基对丛生芽增殖的影响

付镇芳等［14］利用蝴蝶兰大辣椒对基本培养基的增殖情况进行试验，结果表明：不同基本培养基对蝴蝶兰大辣椒的增殖有明显不同的作用，其中MS培养基比1/2MS更有利于不定芽的增殖，增殖系数达2.35。但武爱龙等［17］在蝴蝶兰大辣椒组织培养与快速繁殖的研究中得出，利用花宝一号为基本培养基，丛生芽增殖和分化的最佳培养基为：花宝一号+NAA 0.2 mg/L +6-BA 6.0mg/L，增殖系数为5.53倍。同时，在规模化种苗生产中，普遍利用花宝一号作为诱导和增殖的培养基。

3.3 6-BA对丛生芽增殖的影响

在蝴蝶兰丛生芽的增殖过程中，不同浓度的6-BA具有明显影响。马晓娟等［13］在试验研究中发现，6-BA浓度为5.0 mg/L时，丛生芽生长健壮，且增殖率最高；当6-BA处于1.0 mg/L低浓度时丛生芽增殖减少，当浓度升高至5.0 mg/L增殖率逐渐上升，但6-BA浓度大于5.0 mg/L时增殖率随浓度的上升而下降。李金雨等［18］认为随着6-BA浓度的上升，丛生芽的芽数增多，增殖率上升，各处理间差异达到极显著，表明6-BA对蝴蝶兰丛生芽的增殖具有决定性影响，其中浓度为6-BA 8.0 mg/L时增殖率最高、可达304%，且丛生芽生长健壮，便于下一步的增殖及壮苗生根。当6-BA浓度高于10.0 mg/L时增殖率逐渐上升，但丛生芽生长较弱且有畸形芽出现，不利于增殖。谭鹏鹏等［10］也认为增加6-BA的浓度，增殖率随之上升，当6-BA浓度从5.0 mg/L上升到7.0 mg/L时增殖率达到最高，当增加到10.0 mg/L时增殖率有所下降，表明高浓度的生长激素抑制了芽的分化。

3.4 6-BA及NAA对丛生芽增殖的影响

谭鹏鹏等［10］认为，在6-BA浓度相同、NAA浓度不同的条件下，其增殖系数有所不同，随着NAA浓度的上升，增殖系数也相应地增大，表明NAA对丛生芽的分化有促进作用。华海霞［18］在试验中发现，1.5～2.0 mg/L的6-BA有利于芽的增殖，浓度在2.0 mg/L时增殖效果最好；NAA对增殖作用不明显，但低浓度的NAA具有协同作用［22］，所以最佳增殖培养基为1/2MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L。但杨海芸等［23］和谭巍等［24］在NAA和IAA生长素对蝴蝶兰增殖的试验中发现，NAA要优于IAA且浓度在0.5 mg/L时，增殖率最高，在6-BA和KT两种细胞分裂素中，6-BA优于KT，在6-BA浓度为7.0 mg/L时增殖率最高。张伟等［20］也认为NAA浓度在0.5 mg/L、6-BA浓度在1.0～7.0 mg/L时，丛生芽增殖率逐渐提高，当6-BA浓度为5.0 mg/L时增殖芽数较多且生长强壮；但6-BA浓度达7.0 mg/L时增殖芽数最多，但有畸形芽出现。曾德华等［15］研究发现，6-BA和NAA的最佳浓度为3.0 mg/L和0.5 mg/L或3.0 mg/L和1.0 mg/L时，增殖效果最好。侯义龙等［25］在迷你蝴蝶兰花梗侧芽组织培养技术的研究中发现，6-BA 8.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L最适宜丛生芽的增殖。可见，6-BA浓度过高并不能达到最好的效果，唯有6-BA、NAA在配合使用且适宜浓度下，增殖效果最为理想。

3.5 6-BA及其他激素对丛生芽增殖的影响

杨录军等［26］在蝴蝶兰新品种郑农火凤凰的组培快繁研究中发现，影响丛生芽增殖最大的因素是6-BA，其次是腺嘌呤，然后为CM，丛生芽在1/3MS + 6-BA 2.0 mg/L +腺嘌呤3.0 mg/L+ NAA 0.2 mg/L + CM 100 mL/L的培养基上增殖效果最好。漆子钰等［27］在蝴蝶兰小麻雀的组培快繁研究中发现，6-BA 8.0 mg/L + 蛋白胨0.5 mg/L增殖率最高，表明低浓度的蛋白胨有促进增殖的作用。然而，周全等［28］研究发现，6-BA和TDZ两种激素在蝴蝶兰丛生芽增殖过程中，TDZ的增殖效果优于6-BA，适于丛生芽增殖的培养基为1/3MS + TDZ 2.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L+ 蔗糖20 g/L + 琼脂8.0 g/L + 活性炭2.0 g/L +CM 200 mL/L。

4 壮苗生根

在壮苗生根培养过程中，不同培养基的生根情况不同，其中NAA是关键。李金雨等［18］研究结果表明，MS + NAA 0.5 mg/L + 10%香蕉汁与MS + IBA 0.5 mg/L + 10%香蕉汁对生根的影响没有差异，其它处理均达极显著差异，其中以NAA 0.5 mg/L + 10%椰子汁的培养基对生根的效果最好，平均生根数达3.6条。同时，试验结果还表明，椰子汁或香蕉汁等对生根有良好的促进作用。刘亮等［8］将增殖芽转入1/2MS + NAA 1.0 mg/L和1/2MS + IBA 0.3 mg/L培养基中进行壮苗生根试验，结果表明两种培养基均能诱导生根，但后者生根快，平均根数可达3.3条且生长健壮。谭鹏鹏等［10］研究发现，在生根阶段，添加香蕉泥和活性炭对生根及壮苗有明显促进作用，香蕉泥对pH值有缓冲作用，并且含有天然的腺嘌呤等植物激素，有利于植物根系的生长。马晓娟等［13］发现，椰汁、香蕉泥和土豆泥能明显影响丛生芽增殖和分化，椰汁有利于增殖并促进生根，且显著优于其他两种处理，土豆泥能促进根数和叶片数的增加。张启香等［29］认为，当6-BA与NAA的配比适当时，蝴蝶兰的生根较多，植株长势旺盛且健壮，其中6-BA具有细胞分裂与分化的作用，细胞分裂可以打破顶端优势的影响。郑玉忠等［30］认为壮苗生根对植株的移栽成活具有重要作用，因此应筛选激素种类并找到适宜浓度。

5 褐化防治

张和等［31］认为在蝴蝶兰的组织培养过程中出现的褐变不利于根的形成与生长，褐变是离体培养的无性系植物或进行组织培养时，从植物上切取时伤口所分泌出的酚类物质，在多酚氧化酶的作用下转变成醌类物质所引起，且褐变率会随着培养时间的延长而增加，并生成棕褐色的醌类物质，在培养基中逐渐扩散，同时抑制酶的活性，毒害外植体。其中活性炭具有强大的吸附能力，能吸附非极性分子和色素等大分子，减少有害物质的形成。王立娅等［32］发现，1%活性炭能促进生根，并能防止植物自身的酚类物质排泌和变褐，对繁殖材料的形态发生和器官形成具有良好作用。除了活性炭能抑制Ca+的吸收和防止褐变外，柠檬酸、Vc等物质对缓解褐化也有一定作用，而当pH值在5.4～5.5时，排的褐变物质也相应减少［31］。张伟等［20］发现添加30 mg/L柠檬酸能减少褐化且效果显著，表明柠檬酸能有效降低褐化率、提高诱导率。但段文武等［33］在蝴蝶兰组培的研究中发现，显著抑制褐化且对褐化影响最大的是活性炭，转接周期对褐化的影响次之，对褐化影响从大到小分别为活性炭、转接周期、温度、椰子汁，其中活性炭1.0 g/L、转接周期10 d、温度25℃、椰子汁浓度150 mL/L，为抑制褐化的最优组合。

6 结论与展望

对蝴蝶兰丛生芽组织培养研究进展进行综述，有利于更系统、更完整地了解当前取得的水平和进展情况，能够更好、更快地为种苗生产提供借鉴和服务。综合以上的分析，以花梗为外植体，通过花梗腋芽诱导营养芽成功率较高，其中第2节和第3节最好；外植体消毒灭菌时，0.1%氯化汞消毒8～15 min比次氯酸钠效果好，但不同品种的消毒时间略有差异。在丛生芽诱导中，以1/2MS或花宝一号为基本培养基，6-BA浓度在3.0～7.0 mg/L之间，或6-BA和NAA搭配可诱导出丛生芽；在增殖培养中，6-BA或TDZ对丛生芽增殖有明显影响，NAA在适宜浓度下配合使用，增殖效果更佳，并以MS或花宝一号为基本培养基；在壮苗生根中，主要以低浓度的NAA或IBA，并配以椰子汁或香蕉汁、土豆汁等有机物对壮苗生根促进作用明显。在众多防褐化因子中，活性炭能显著抑制褐化且对褐化的影响最大，转接周期对褐化的影响次之，对褐化影响从大到小分别为活性炭、转接周期、温度、椰子汁，其中活性炭1.0 g/L、转接周期10 d、温度25℃、椰子汁浓度150 mL/L为抑制褐化的最优组合。

虽然蝴蝶兰组织培养的研究目前已经取得了相当大的研究成果，但仍然存在一些问题，特别是不同品种其消毒时间、诱导率、增殖率、转接周期等均有差异，因此，需要更深入、细致地对不同类型的蝴蝶兰进行研究，找出适合自身的最佳消毒时间、培养基配方及转接周期等，才能在生产中推广应用。

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