PCR衍生技术快速检测副溶血弧菌的研究进展

毕水莲,罗永文,关小莺

(1.广东药科大学 食品科学学院，广东 中山 528458；2.华南农业大学 兽医学院，广东 广州 510642)

PCR衍生技术快速检测副溶血弧菌的研究进展

毕水莲1,罗永文2,关小莺1

(1.广东药科大学 食品科学学院，广东 中山 528458；2.华南农业大学 兽医学院，广东 广州 510642)

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是引发食物中毒的重要病原菌，因此，快速、准确地对食品中副溶血弧菌进行检测是预防该菌引起食物中毒的关键。综述了近年来国内外利用PCR衍生技术快速检测该菌的研究进展，为该菌检测方法的应用与开发提供一定的参考和理论依据。

副溶血弧菌;聚合酶链反应;食源性致病菌；检测方法

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一种重要的食源性致病菌，主要存在于鱼虾贝类等海产品中。食用了被该菌污染的海产品时，容易出现腹泻、腹痛、恶心、呕吐等急性胃肠炎症状[1-2]。近年来，由副溶血弧菌引发的食物中毒人数呈明显上升的趋势，已超过沙门氏菌食物中毒人数，跃居首位。因此，建立一种快速、准确的检测副溶血弧菌的方法，对控制和预防该菌引起的食源性疾病具有重要意义。目前，聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是检测食源性致病菌应用最广泛的技术，以普通PCR为基础，又衍生出许多新技术。本文就近年来国内外在检测副溶血弧菌时采用的各种PCR衍生技术的研究进展进行了综述。

1 多重PCR检测技术

多重PCR(multiplex PCR)又称多重引物PCR或复合PCR，是指在一个PCR反应体系中包括2对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR方法。多重PCR技术具有简便、经济、高效、高通量等优点，因此在食品检测中得到了广泛应用[3]。但由于某些致病菌在食品中的菌体含量较低，直接检测不易被检出，可能会造成漏检，且食品中成分非常复杂，可能存在许多抑制或干扰PCR反应的因素，导致出现假阴性结果，在试验过程中，多对引物同时扩增，如果试验条件控制不当，也很容易导致扩增失败或出现非特异性扩增，此外，引物的设计、DNA提取方法等也都会对检测结果产生重要影响。

Whistler等[4]应用多重PCR方法对副溶血弧菌的ST36型进行了鉴定，准确率达99%以上，与培养法相比，具有更高的灵敏度和特异性。Malcolm等[5]分别采用多重PCR和环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法对农贸市场和超市的贝类和甲壳类动物进行副溶血弧菌的监测，当检测靶基因为tdh时，这2种方法无明显差异，但检测靶基因为trh时，LAMP法比多重PCR法具有明显的优势。

2 巢式PCR方法

巢式PCR(nested-PCR)可细分为完全巢式PCR和半巢式PCR(seminested-PCR)，前者是指使用1对引物对目标片段进行扩增后，在这对引物之间再设计1对引物对第1对引物的扩增产物进行二次扩增；后者是在第1对引物之间加1条引物，利用2对(3条)引物先后进行扩增。通过巢式PCR可从极微量的模板中获得高浓度和高纯度的靶基因片段，避免因第1对引物扩增产量低和目标基因含量低而造成假阴性，大大提高了PCR方法的灵敏度(通常比常规PCR灵敏度高100倍以上)。但该法存在进行第二次PCR扩增时易引起交叉污染的缺点。张德福等[6]以VP1331基因作为副溶血弧菌的种特异性标记基因，建立了一种可快速、特异地检测海产品中副溶血弧菌的方法，该方法的最低检测限可达副溶血弧菌基因组DNA 10 fg、纯培养物6.6 CFU。

3 实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)是指在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR的进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。RT-qPCR所使用的荧光物质可分为2种：荧光探针和荧光染料。常用的荧光探针有TaqMan探针、分子信标、双杂交探针等；最常用的荧光染料则是SYBR Green[7]。RT-qPCR结合利用了PCR技术的核酸扩增高效性，探针技术的高特异性，光谱技术的高敏感性和高精确定量等多种优点，且操作完全封闭，仪器直接读数，结果判断更加客观真实。

Rehnstam-Holm等[8]利用RT-qPCR技术检测了不同季节热带沿海地区副溶血弧菌。He等[9]以副溶血弧菌的toxR、tdh、trh基因为靶基因，建立了EvaGreen多重RT-qPCR检测副溶血弧菌的方法。该方法特异性好，灵敏度高，检测限可达1.4 pg DNA，能够高通量检测副溶血弧菌。Garrido-Maestu等[10]建立了基于特异性引物和探针检测副溶血弧菌、霍乱弧菌(Vibriocholerae)和创伤弧菌(Vibriovulnificus)的RT-qPCR方法，检测限低于10 CFU/25 g。

由于许多食品基质、培养基、核酸提取试剂等都可能会对RT-qPCR的荧光信号产生抑制，导致检测敏感性显著降低，甚至出现假阴性结果，严重影响该精确定量技术的适用性，是迄今为止RT-qPCR全面引入常规食品检测的一大障碍。而且探针成本较高、检测仪器昂贵等诸多因素也给RT-qPCR在基层单位的推广应用带来很多困难。

4 连接介导PCR方法

连接介导PCR(ligation-mediated PCR, LM-PCR)方法是以连接反应为基础的单侧PCR技术，通过在DNA片段的一端连接上已知序列，使用与此已知序列互补的引物专一性地扩增目的DNA片段的方法[11]。LM-PCR方法能够将断裂后的DNA片段大量扩增，显著提高了检测的灵敏度，同时具有受样品质量影响小、扩增效率高的优点，特别适用于目标DNA含量低或破坏程度高的样品的分析，但也存在模板片段间可能发生自连的弊端。Pan等[12]采用IIS型限制性内切酶(BbvI和Alw26I)对模板DNA进行酶切，产生具有随机碱基粘性末端的片段以减少片段间自连的概率，并使用一组含有随机碱基的接头混合物与模板片段进行连接，最终使用通用引物实现副溶血弧菌基因组的高灵敏度和高效全扩增。

5 免疫磁分离-荧光PCR方法

免疫磁分离技术(immunomagnetic separation,IMS)是指以免疫捕获为基础的浓缩分离技术。它通过将特异性抗体偶联在磁性颗粒的表面组成免疫磁珠特异性吸附目标微生物，载有目标微生物的磁珠在外加磁场的作用下向磁极的方向聚集，能够直接从样品或增菌培养基中分离目标菌。因此，IMS代替了常规的分离、浓缩，也代替了常规的选择性增菌培养过程，能够特异有效地将目标菌从样品中快速分离[13]，但对大体积样本中微量目标菌的检测灵敏度略低。在实际应用中，IMS技术常与PCR技术结合使用，使免疫磁性分离技术的应用更加广泛。张蕾等[14]建立了海产品中副溶血弧菌纳米免疫磁分离-荧光PCR(immunomagnetic separation-fluorescent PCR,IMS-FPCR)检测方法。纳米免疫磁珠在菌体浓度为103CFU/mL水平时，对副溶血弧菌的捕获率达到74%。在纯培养、无需增菌的情况下，该方法的检测灵敏度可达140 CFU/mL。

6 PCR-变性梯度凝胶电泳方法

PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-denaturing gradientgel electrophoresis,PCR-DGGE)技术于1993年首次应用于分子微生物学研究领域，近几年来，开始逐步应用于食品中微生物的分离与鉴定、食品发酵过程中微生物群落的动态监测、食品质量监测与控制等方面[15-16]。该技术对操作人员经验的要求较高，但与传统微生物研究方法相比，它具有不依赖于培养、可靠性强、重现性高、能快速分析大量样品、容易操作等优点，因此应用前景广阔。

苏婷等[17]采用PCR-DGGE技术分析比较了34株分离于环境和水产养殖动物体内的副溶血弧菌及标准株16 S～23 S rDNA间区的多态性和亲缘关系。结果表明，34株副溶血弧菌经PCR-DGGE电泳后均能分离出4～10条条带，共产生15个多态性位点，较好地实现了副溶血弧菌的基因分型。Liao等[18]应用PCR-DGGE技术构建了熟虾中副溶血弧菌和单增李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)在4 ℃和10 ℃时的生长和生存预测模型，为分子预测模型的构建提供了一种新方法。

7 PCR-变性高效液相色谱方法

DHPLC是基于高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法在分子DNA水平上进行微生物检测的一种新方法。PCR-变性高效液相色谱(PCR-denaturing high performance liquid chromatography,PCR-DHPLC)法是利用PCR结合DHPLC快速检测PCR扩增产物的新技术。该技术对基因突变、小片段核苷酸的插入或缺失等DNA序列变异的检测具有快速、准确、经济、灵敏、自动化和高通量的特点[19]，可准确、稳定地从种属和菌株水平识别微生物，弥补传统表型识别方法的缺陷；能够自动分析检测混合微生物样本中的所有微生物；能够根据特定样本中各种微生物的峰形对目标菌进行鉴定，样本的峰形谱可用于定性和定量监测样本中各种微生物的动态变化。该技术美中不足的是检测仪器昂贵，成本较高，在一定程度上限制了该技术的推广应用。

Xu等[20]建立了多重PCR-HPLC方法同时检测海产品中副溶血弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌(Vibriovulnificus)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)和拟态弧菌(Vibriomimicus)。该方法的特异性好，灵敏度高达约10 CFU/mL(g)纯培养物或食物匀浆。钱云开等[21]建立了检测水产品中包括副溶血弧菌在内的5种常见致病菌的多重PCR-DHPLC方法，具有良好的重现性和特异性，对副溶血弧菌的检测灵敏度为280 CFU/mL。不同水产品的状态、成分以及增菌液类型对检测结果不产生影响，可以很好地满足实际食品中微生物检测的要求。

8 PCR-酶联免疫吸附法

PCR-酶联免疫吸附法(PCR-enzyme-linked immunosorbent assay,PCR-ELISA)是将PCR方法与免疫学ELISA方法结合起来的一种技术，主要是利用ELISA方法检测PCR扩增产物来代替电泳检测，兼具PCR的高敏感性和酶标仪直接读取结果的客观性等优点，但容易产生污染而引起假阳性，且操作略显繁琐[22]。Di Pinto等[23]应用PCR-ELISA方法对贝类中副溶血弧菌进行了检测，结果表明：所建立的PCR-ELISA方法是一种经济、快速、特异、敏感的检测方法，每份样品检测成本大约为9欧元，从DNA提取到检测完成仅需8 h，与传统凝胶电泳检测方法相比，对贝类中副溶血弧菌的检测灵敏度提高了100倍。

9 最大可能数方法

最大可能数(most-probable number,MPN)方法是一种采用多管发酵法，应用概率理论来估算样品中含有细菌的最大可能数，已广泛用于食品病原菌及工农业微生物的定量检测，但操作繁琐、耗时长[24]。将MPN技术与PCR技术结合，即最大可能数-PCR(most-probable number PCR,MPN-PCR)方法，可以简化实验室操作流程，使操作过程更加简便快捷，且更节省材料。目前，MPN-PCR法已被公认为最有发展前景的定量检测技术之一。New等[25]采用MPN-PCR方法测定生蚝中副溶血弧菌的带菌情况，结果表明：MPN-PCR方法可以用于生蚝的微生物风险评估。Aranda等[26]应用MPN-PCR方法对智利南部内海中蛤蜊和蓝贻贝携带的副溶血弧菌的tlh、tdh、trh基因进行检测，以评估智利南部内陆海中副溶血弧菌的分布。

10 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method, LAMP)是一种新型的核酸扩增技术，其原理是针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，在具有链置换活性的Bst DNA聚合酶的恒温条件下(60～65 ℃)，15～60 min可实现靶序列1×109～1×1010倍的扩增。扩增产物可根据反应中有无产生白色焦磷酸镁沉淀直接鉴定，或通过加入染料进行实时检测，也可以通过扩增产物的浑浊度对初始序列进行定量分析。由于LAMP不需要使用PCR仪和昂贵的试剂，且具有操作简单、快速准确、特异性强、灵敏度高等优点，在临床诊断、细菌或病毒的定性定量检测、转基因食品检测及动物胚胎性别鉴定等方面应用广泛[27-28]。由于灵敏度极高，LAMP反应后一旦开盖很容易形成气溶胶污染，假阳性问题相对比较严重。

Yamazaki等[29]针对副溶血弧菌的tlh基因设计特异性引物，建立LAMP方法并用于检测171份海产品中该菌的污染情况，结果建立的LAMP方法灵敏度和特异性分别达到100%和90.8%，比传统方法检出率更高，适用性更强。Di等[30]开发了一种快速检测副溶血弧菌的LAMP方法，对该菌的富集过程进行了优化，可在3 h内检测含量非常低的副溶血弧菌，完整的测定过程最短仅为5 h，适用于大量环境和海鲜样品中副溶血弧菌的快速筛选。

11 结语

PCR衍生技术的发展为副溶血弧菌的检测提供了快速、灵敏、准确的手段。综上所述，以上每种检测方法都有各自的优缺点，但与传统的副溶血弧菌检测方法相比，均具有明显的优势。在临床和食品实际样品检测时，应根据每种方法的特点、优势及适用范围合理选择使用，并在实验过程中不断积累经验，优化各项技术。随着分子生物学技术的快速发展，各种分子技术的融合与创新，PCR技术将具有更广阔的发展空间，必将会带动副溶血弧菌的检测向着更快速简便、更灵敏特异、更高通量、成本更低的方向飞速发展。

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(责任编辑：曾小军)

Research Advances in Rapid Detection ofVibrioparahaemolyticusby Derivative Techniques of PCR

BI Shui-lian1, LUO Yong-wen2, GUAN Xiao-ying1

(1. College of Food Science, Guangdong Pharmaceutical University, Zhongshan 528458, China; 2. College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Vibrioparahaemolyticusis an important pathogen causing food poisoning. The key to prevent the food poisoning caused byV.parahaemolyticusis the rapid and accurate detection of this pathogen in food. This paper summarized the recent research advances in the rapid detection ofV.parahaemolyticusby the derivative techniques of PCR in the world, in order to provide reference and theoretical basis for the application and development of this pathogen detection methods.

Vibrioparahaemolyticus; Polymerase chain reaction; Food-borne pathogen; Detection method

2017-04-18

国家自然科学基金资助项目(31401596);广东省科技计划项目(2014A040401087、2016A020210132);广东省广州市珠江 科技新星专项资助项目(201710010003)。

毕水莲(1982─)，女，副教授，博士，主要从事食品安全及检测技术研究。

TS201.3

A

1001-8581(2017)08-0105-05