铁皮石斛组织培养研究*

彭智华，罗绍强

（肇庆市国有葵垌林场，广东 广宁526332）

铁皮石斛（Dendrobium catenatum），又名黑节草、云南铁皮，为兰科石斛属多年生附生草本药用植物[1]。其主要分布在亚热带地区，而在我国主要分布于广西壮族自治区西北部、云南省东南部、安徽省西南部、浙江省东部、福建省西部等地[2]。在道家医学典籍《道藏》中，铁皮石斛被列为“中华九大仙草”之首，并且在李时珍的《本草纲目》中也有记载[3]。铁皮石斛内含有多种石斛碱、石斛多糖等[4]。现代医学研究发现,铁皮石斛的药用有效成分具有降低血糖、增强机体免疫力的作用[5]，并且具有良好的抗肿瘤、抗衰老作用[6]。但是铁皮石斛对自然生长条件要求非常苛刻，需要与某些真菌共生，繁殖率极低，为此何春梅等[7]还针对菌根真菌对铁皮石斛的共生专一性与促进作用进行研究。所以对铁皮石斛进行组培快繁研究进而大量繁殖，是推动其产业发展、发挥其药用价值的重要途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为广东省林业科学研究院培育的铁皮石斛3 a生健壮实生苗。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的消毒 从植株上剪取长度4～10 cm的中间茎段，用肥皂水轻轻擦洗，在流水下冲洗1 h。然后在超净工作台上用75%的酒精消毒1 min后进行外植体消毒试验，不同消毒处理分别为：0.1%的HgCl2溶液消毒3、5、7、9 min和NaClO3溶液消毒5、10、15、20 min。再用无菌水冲洗4～5次，置于灭菌后的滤纸上吸干水分，将带芽茎段剪成1.5 cm左右接种于基础MS培养基上。每个处理30瓶，每瓶1茎段。

1.2.2 诱导培养基的筛选 试验设置6种诱导培养基，分别为：

（1）MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.2 mg/L+3%蔗糖

（2）MS+6-BA0.5 mg/L+NAA1.0 mg/L+KT0.2 mg/L+3%蔗糖

（3）MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.2 mg/L+3%蔗糖

（4）MS+6-BA1.0 mg/L+NAA1.0 mg/L+KT0.2 mg/L+3%蔗糖

（5）MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.2 mg/L+3%蔗糖

（6）MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.2 mg/L+3%蔗糖

每个处理30瓶，每瓶接种3茎段。观察记录，30 d后统计外植体的生长状况。

1.2.3 继代培养基的筛选 待新芽长成后，将其剪成1.5 cm左右带芽茎段，转接到继代培养基中。试验设置4种继代培养基，分别为：

（1）MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+5% 香蕉提取液+KT0.2 mg/L+3%蔗糖

（2）MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+5% 香蕉提取液+ KT0.2 mg/L+5%水解酪蛋白500 mg/L+3%蔗糖

（3）MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+5% 马铃薯提取液+KT0.2 mg/L+3%蔗糖

（4）MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+5% 马铃薯提取液+KT0.2 mg/L+5%水解酪蛋白500 mg/L+3%蔗糖

其中香蕉提取液是取成熟香蕉去皮，加适量蒸馏水煮熟后，用4层纱布过滤后的汁液。马铃薯提取液是将马铃薯洗净切片，加适量蒸馏水煮熟后，用4层纱布过滤后所形成的汁液。

每个处理30瓶，每瓶接种3茎段。观察记录，30 d后统计生长状况。

1.2.4 生根培养基的筛选 选取高1.5 cm以上生长健壮的幼苗，接种于生根培养基上。生根培养基设5种激素组合，分别为:

（1）1/2MS+6-BA0.1 mg/L+IBA0.3 mg/L+5%香蕉提取液+2%蔗糖

（2）1/2MS+6-BA0.1 mg/L+IBA0.5 mg/L+5%香蕉提取液+2%蔗糖

（3）1/2MS+6-BA0.1 mg/L+IBA0.7 mg/L+5%香蕉提取液+2%蔗糖

（4）1/2MS+6-BA0.1 mg/L+IBA1.0 mg/L+5%香蕉提取液+2%蔗糖

（5）1/2MS+6-BA0.1 mg/L+IBA1.5 mg/L+5%香蕉提取液+2%蔗糖

每个处理20瓶，每瓶接种3茎段，观察记录生根情况，50 d后统计生根率。

1.2.5 炼苗移栽 生根培养60 d后，将培养瓶移至温室中炼苗1～3 d，挑取生根健壮的组培苗，用清水洗去根部附着的培养基，移栽入配比好的基质中，浇透水后用塑料覆盖以保湿保温，每日进行透气，保持湿度。7 d后撤走覆盖物，30 d后统计移栽成活率。

2 结果与分析

2.1 不同消毒剂和消毒时间对铁皮石斛嫩茎诱导影响

如表1所示，不同的消毒试剂以及消毒时间对外植体的诱导有着明显的影响。用HgCl2处理的嫩茎随着消毒时间的增加，污染数不断减少，消毒9 min的嫩茎仅有2个污染，但是随着消毒时间的增加，外植体的死亡数也不断增加。结合污染率与死亡率可知，在用HgCl2消毒时，消毒5～7 min最适宜。用NaClO3处理的嫩茎污染数也随着消毒时间的增加而减少，嫩茎死亡数增加，处理约15 min的污染率与死亡率最小。但是与HgCl2处理相比，用NaClO3处理的嫩茎污染率较高，死亡率较小。综合考虑，用HgCl2试剂消毒5～7 min效果最好。

2.2 不同激素水平对铁皮石斛嫩茎诱导的影响

从表2可以看出不同生长激素的配比对铁皮石斛嫩茎的诱导有着明显影响。在6-BA质量体积浓度为0.5 mg/L时，铁皮石斛苗生长缓慢，并且芽较少，有的苗还产生了愈伤组织。随着6-BA质量体积浓度的提高，芽多且小苗萌动加快，在所有的诱导培养基中，当6-BA质量体积浓度为1.5、NAA为0.5 mg/L时，芽最多并且小苗生长茁壮，诱导率达到了96%，再加上0.2 mg/L的KT，这个生长激素的配比最有利于芽的萌动和伸长。综上所述，最适宜铁皮石斛嫩茎诱导的培养基为MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.2 mg/L+3%蔗糖。

2.3 不同培养基对铁皮石斛继代增殖的影响

从表3可以看到，铁皮石斛组培苗在添加5%香蕉提取液的培养基中长势要好于添加5%马铃薯提取液的培养基。在添加5%马铃薯提取液的培养基中，小苗芽较少，长势较弱，增值系数较低，并且伴随有玻璃化的现象。而在添加5%香蕉提取液的培养基中加入5%的水解酪蛋白更有助于组培苗的增殖，增值系数达到8.0，并且小苗叶片舒展，生长健壮。所以，最适宜铁皮石斛组培苗继代的培养基是MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.2 mg/L+5%香蕉提取液+5%水解酪蛋白+3%蔗糖。

2.4 不同培养基对铁皮石斛的生根影响

在生根培养中，5种处理对铁皮石斛的根诱导效果差异明显。从表4中可以看出，随着培养基中IBA质量体积浓度的提高，铁皮石斛的生根率也提高，但是过高的IBA质量体积浓度又抑制了铁皮石斛的生根。其中，在IBA质量体积浓度为1.0 mg/L时，铁皮石斛的生根率最高，达到了97%，并且试管苗长势良好，茎粗壮，主根又长又粗，最粗可达0.2 cm，侧根多而壮。综上所述，最适宜铁皮石斛组培苗生根的培养基为1/2 MS+6-BA 0.1 mg/L+IBA1.0 mg/L+5%香蕉提取液+2%蔗糖。

表1 不同消毒试剂及消毒时间对铁皮石斛嫩茎诱导的影响Tab.1 Effect of different disinfectant and disinfection time on the tender stems of Dendrobium catenatum

表2 不同激素水平对铁皮石斛嫩茎诱导的影响Tab.2 Effect of different hormone levels on the induction of the tender stems of D. catenatum

表3 不同培养基对铁皮石斛继代增殖的影响Tab.3 Effects of different media on subculture proliferation of D. catenatum

表4 不同培养基对铁皮石斛的生根影响Tab.4 Effect of different culture medium on rooting of D. catenatum

2.5 炼苗移栽

将炼好的苗移栽到温室中，30 d之后统计的成活率高达90%以上，植株生长迅速，叶片舒展，生根速度快，茎段明显健壮，为室外移栽的成活打下了良好的基础。

3 结论与讨论

3.1 试验表明，铁皮石斛外植体嫩茎用HgCl2试剂消毒5～7 min效果最好，最佳诱导培养基为MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.2 mg/L+3%蔗糖，最佳继代培养基是MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.2 mg/L+5%香蕉提取液+5%水解酪蛋白+3%蔗糖（增殖系数达8.0），最佳生根培养基为1/2MS+6-BA0.1 mg/L+IBA1.0 mg/L+5%香蕉提取液+2%蔗糖（生根率达97%），炼苗后移栽成活率高达90%以上。

3.2 本实验在培养基中加入了香蕉提取液、马铃薯提取液以及水解酪蛋白等，前人在研究中也曾尝试加入不同的天然提取液，得到的结果也大不相同。张明等[8]和罗万业等[9]认为椰子汁对铁皮石斛的增殖效果最好，而蒋林等[10]和张华通等[11]认为苹果汁和香蕉汁更能促进试管苗根的生长。本实验研究发现，5%香蕉提取液加上5%的水解酪蛋白更有助于铁皮石斛苗的增殖。

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