猪弓形虫病实验室检测方法研究进展

庄金秋，梅建国，张 颖，杨丽梅，李 峰，沈志强

（山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

猪弓形虫病实验室检测方法研究进展

庄金秋，梅建国，张 颖，杨丽梅，李 峰，沈志强

（山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

弓形虫病是一种世界性的人兽共患寄生虫病，可引起孕妇流产、死胎，儿童生长发育受阻及家畜高热、繁殖障碍性疾病等，给世界养猪业造成很大危害。猪弓形虫病目前尚无特效治疗药物和方法，加强养殖环节对该病的预防控制措施，提高猪产品中弓形虫检测技术水平，是预防和控制该病的关键。文章综述了猪弓形虫病最新实验室检测方法研究进展，以期为兽医科研工作者和广大养猪业主更好地防治该病提供参考。

弓形虫；猪弓形虫病；检测；研究进展

弓形虫病（Toxoplasmosis）由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的一种人兽共患原虫病。人感染该病主要引起孕妇的流产、弱胎、畸胎、死胎和儿童生长发育受阻、死亡等，已成为优生优育的大敌。家畜中，我国以猪的感染较为多见，主要以高热、呼吸困难、神经症状以及繁殖障碍为特征。据了解，我国养猪场中曾大规模暴发弓形虫病，导致猪群无名高热，所引起的死亡率高达 60%以上，给畜牧业生产造成了很大的经济损失。近年弓形虫病血清学调查显示，猪弓形虫病感染率均很高，且呈逐年上升趋势。患弓形虫病的猪及其肉制品往往是人类感染弓形虫病的重要传染源之一，食用未熟的肉或肉产品对人体存在着感染的危险。弓形虫的终末宿主是猫及猫科动物，对养猫的家庭要定期进行弓形虫病检测，以确保安全。猪弓形虫病严重威胁着动物健康和人类公共卫生安全，因此实时监测猪群弓形虫感染对正确防控该寄生虫病尤为重要。由于猪感染弓形虫后多为隐性感染，它的临床症状和病理变化与猪瘟相似，需要进行实验室检测才能确诊。本文综述了猪弓形虫病近年来实验室检测方法研究进展，以期为科研工作者和广大养猪业主更好地防制该病提供参考。

1 病原学检测方法

病原学检测方法包括直接涂片染色或组织切片染色观察法、动物接种或细胞培养法、卵囊检查法等。该方法是从病料中查出弓形虫存在最可靠的方法，缺点是敏感性低、耗时长、容易漏诊[1]。

2 血清学检测方法

2.1 凝集试验

主要包括直接凝集试验（DAT）、间接血凝试验（IHAT）、乳胶凝集试验（LAT）及改良凝集试验（MAT）。IHAT 主要用于大规模的流行病学调查。Senet等（1976）[2]证实 IHAT 检测 IgM 抗体更敏感，且比间接免疫荧光试验（IFAT）更能检测低滴度弓形虫抗体。王 天 奇 等（2006）[3]、王海 燕等（2008）[4]先 后 以 IHAT方法调查河南洛阳地区猪弓形虫感染情况，表明该地区猪弓形虫感染有明显上升趋势。罗才庆等（2012）[5]应用 酶 联 免 疫吸 附 试 验（ELISA）和 IHAT两种方法，平行检测来自福建龙岩市某个猪场的32份猪血清中的抗弓形虫特异性抗体。结果ELISA 和 IHAT 对猪弓形虫抗体阳性检出率分别为 62.5%（20/32）、53.13%（17/32）。其中，ELISA 方法的敏感性、检测效率都在 IHAT 方法之上，但ELISA 方法的特异性略低于 IHAT 方法。王贝贝等（2012）[6]发现 MAT 方法 适 合 于 对 初 筛 样本以及临床上疑似弓形虫感染个体的筛查，但该法费时、费力 ，不宜在 基 层推 广 使 用 。Lorry 等（2012）[7]认 为MAT可用于畜群血清学检测，且该法可作为检测组织液的良好候选法。

2.2 ELISA

ELISA 是国内外多数学者和实验室检测弓形虫抗体最常用的方法。管刚等（2008）[8]用弓形虫的重组蛋白 P30 作为抗原建立了 ELISA 方法，对青海省互助县所收集的 139 份猪血清抗体进行猪弓形虫病检测。共检出阳性血清 8 份，阳性率为 5.76%。同时应用 IHAT 方法检出的阳性率为 13.67%，ELISA 检测的阳性率明显低于 IHAT 检出的阳性率，但用免疫成色反应（ICT）验证后，结果跟 ELISA 结果具有很高的相符性。江涛等（2009）[9]应用弓形虫重组微线体蛋白 3（rMIC3）作为包被抗原建立了间接 ELISA 方法，用于猪弓形虫抗体的检测。以 ELISA 与 LAT 平行检测 471 份猪血清样本，弓形虫抗体阳性检出率分别为 39.49%和 44.16%，两者总符合率为 92.56%。罗 才 庆等 （2012）[5]对 ELISA 和 IHAT 比较 发 现，ELISA 更适用于猪弓形虫抗体检测。杨亚晓等（2014）[10]对临床上常用的金标法、IHAT、ELISA 对弓形虫 IgG 抗体的检测效能进行比较分析发现，ELISA 检测弓形虫 IgG 抗体的敏感性和特异性较高，适合于大规模的弓形虫 IgG 抗体筛查。丁邦胜等（2014）[11]建 立 了 3 种 重 组 抗 原（rSAG1+rHXGPRT+ rAK） 混合的间接 ELISA 方法，检测弓形虫 IgM 和IgG。Bartomiej等（2015）[12]使用 5 组弓形虫重组嵌合抗原建立 ELISA 方法检测 3 个不同的群体家畜动物（马、猪、羊）血清中的 IgG，结果得到所有嵌合抗原具有高特异性（100%），其中最有效的弓形虫病诊断的重组抗原是 SAG2-GRA1-ROP1L。许正茂等（2016）[13]以弓形虫 TgSAG2 蛋白作为包被抗原对新疆巴州地区 433 份猪血清样品进行了 ELISA 检测。结果显示，平均阳性率为 12.70%（55/433）。其中，散养猪场阳性率为 16.83%（35/208），规模化养殖场为9.94%（16/161），散养猪场阳性检出率显著高于规模化养殖场。邵晓冬等（2014）[14]采集河南洛阳地区规模化养殖场和散养户母猪、肥育猪、保育猪血清样品 410 份，应用 ELISA 方法检测抗弓形虫 IgG 抗体。结果发现猪弓形虫血清抗体阳性率达 35.4%，母猪、肥育猪 和保育猪 的分别是 50.4%、34.5%、22.2%。规模养殖场母猪及肥育猪阳性率极显著或显著低于散养户，说明猪弓形虫的感染与饲养管理水平尤其是卫生管理水平有直接关系。猪弓形虫病目前市场上的各种 ELISA 诊断试剂盒质量参差不齐，进口试剂盒与国产试剂盒的符合率、敏感性和特异性都存在较大差距。何勇等（2011）[15]以人工感染弓形虫的猪阳性血清 42份及感染前的阴性血清45 份为样品，比较 3 个国产（A、B、C）和 2 个国外（D、E）ELISA 试剂盒检测猪弓形虫病的敏感性。结果表明 5种试剂盒中，1种国产试剂盒的检测结果与 PCR 结果完全一致，其余 4 种试剂盒的检测结果都与 PCR 检测结果差别较大。白昀等（2013）[16]建立的间接 ELISA 试剂盒与商品化试剂盒的符合率达到 95%左右。因此，临床选用试剂盒时，可从性价比方面考虑，不必完全依赖进口试剂盒，完全可选用质优价廉的国产试剂盒，在确有必要引进国外试剂盒时，也应选用质量稳定可靠的产品。

3 分子生物学检测方法

3.1 PCR

ELISA 方法虽然操作方便，且较为敏感，但检测结果并不能准确表明动物体内弓形虫的存在位置和数量。PCR 方法受检测样品中弓形虫分布及存在数量的影响，其敏感性低于 ELISA，但 PCR 的阳性结果可表明弓形虫在组织中的存在。目前，根据研究者选择弓形虫基因组中拷贝数和保守型的不同，PCR检测技术的灵敏度、特异性也有所不同，常作为弓形虫检测的基因有 200～300 个拷贝的 529 bp 重复序列，基于 35 个拷贝数的 B1 基因、P30 基因、核糖体第一内转录间隔区（ITS-1 序列）等。

Homan 等（2000）[17]从弓形虫基因组中鉴定出一个可作为遗传标记用于弓形虫与其他寄生虫的种间鉴定的 200～300 个拷贝的 529 bp DNA 片段。宋慧群等（2007）[18]对中国来源于不同宿主、不同地域的 9个弓形虫虫株及国际标准强毒株（RH 株）之间在529 bp 重复序列的变异进行研究，进一步证实了该DNA片段可用于种间鉴定，但不适合用于弓形虫种内遗传变异及毒力相关的研究。Edvinsson 等（2006）[19]针对 529 bp 重复序列 181～274 bp 位设计引物，扩增产物 94 bp，扩增效率为 1.95，检测下限约为 1 个弓形虫速殖子。Opsteegh 等（2010）[20]针对 529 bp 重复序列 243～405 bp 位设计引物，扩增产物 163 bp，扩增效率大于 1.85，检测下限约 0.14 个速殖子。赵东岳等（2013）[21]针 对 529 bp 重 复 序 列 178～376 bp位设计引物，扩增产物为 199 bp，扩增效率为96.724%，最低检出限仅为 173 个拷贝。候照峰等（2015）[22]针对 529 bp 重复序列 268～359 bp 位设计引物，扩增产物大小 92 bp，扩增效率高达 1.999，检测下限 10 个拷贝，约 0.03～0.05 个速殖子。B1 基因是从弓形虫RH株基因组文库中克隆筛选的一个2.2 kb 的片段，它是在整个基因组中有 35 个拷贝的串联重复片段，Hoyen 等（1992）[23]应用 B1 基因设计合成一对扩增片段长度为 194 bp 的引物，成功建立了一种巢式 PCR 方法，用于检测病人血液样品中的弓形虫。王海燕等（2008）[4]以 B1 基因作为弓形虫种特异的遗传标记，建立诊断弓形虫病特异性的 PCR方法，最低能检测到 10 个弓形虫速殖子 DNA。P30基因为编码弓形虫速殖子表膜蛋白，Sawa 等（1990）[24]首先应用 P30 基因设计引物进行 PCR 检测，发现对所检测的7株弓形虫株都能扩增，且对任何其他寄生虫与微生物都未见扩增。崔平等（2009）[25]以 P30基因设计引物建立的 PCR 方法，最低能检测到 5 个弓形虫速殖子的 DNA。孔得翔等（2009）[26]以 P30 基因设计了 3 条特异性引物，建立了半巢式 PCR 方法，最低检测的 DNA 含量为 18 fg。ITS 序列是各物种间相对较为保守的序列，已成为在序列水平上探讨科内属间及种间遗传关系的有效手段。Homan 等（1997）[27]已证实 ITS-1 可作为分子标记物用于弓形虫与其他原虫的种间鉴定。Jauregui等（2001）[28]根据弓形虫 ITS-1 序列设计引物，建立了猪弓形虫病的PCR 检测方法，敏感性最少可检 100 fg DNA，相当于一个虫体 DNA 的含量，且与其他 8 种原虫均无交叉现象，而且虫体发育的任何阶段都能检出，提示可用于临床诊断和猪肉产品的检验。国内谢德华等（2005）[29]以 ITS-1 序列作为弓形虫种特异性的遗传标记建立了 PCR 方法。廖申权等（2006）[30]应用该法对2例猪弓形虫病进行了特异诊断。邵国青等（2008）[31]以弓形虫 ITS-1 序列为遗传标记并与鸡柔嫩艾美耳球虫在同一扩增体系中扩增，表明 PCR 方法最低可以检测 1 pg弓形虫速殖子 DNA（相当于10 个速殖子的 DNA），仅出现弓形虫特异性条带。黄翠琴等（2012）[32]分别以弓形虫 ITS-1 序列和 529 bp重复序列为目的片段，扩增2例疑似猪弓形虫病的病料肺门淋巴结 DNA，对疑似猪弓形虫病的病料进行 PCR 诊断。弓形虫微线体蛋白 MIC 是分布于虫体前端棒状体周围的微线体所分泌的黏附因子，与虫体对宿主细胞的识别和结合有关，在虫体入侵宿主细胞早期阶段发挥重要作用。MIC3 是其中非常重要的微线体蛋白，由于 MIC3 在弓形虫的速殖子、缓殖子和子孢子期都能表达，这在弓形虫病的早期诊断中具有重要价值。任科研等（2011）[33]以微线粒体MIC3 基因作为弓形虫特异的遗传标记，建立了猪弓形虫特异 PCR 检测方法。最低能检测到 10 个弓形虫速殖子的 DNA，为今后的弓形虫基因重组疫苗奠定了基础。

3.2 荧光定量 PCR

王频佳等（2005）[34]、Lin 等（2012）[35]先后建立了以弓形虫 529 bp 重复序列作为检测的靶基因的荧光定量 PCR。候照峰等 （2015）[22]也以高度保守的529 bp 重复序列作为靶基因，建立了荧光定量 PCR检测方法，应用该法检测兽医院门诊送检的 24 头病死猪，发现弓形虫阳性率为 70.8%，略高于常规 PCR方法的检出率（66.7%），但检测的 69 个组织样品中，荧光定量 PCR 方法的检出率（50.7%）明显高于常规PCR 方法的检出率（34.8%）。朱祥明等（2007）[36]建立了以 B1 基因作为检测的靶基因的弓形虫 SYBR Green Ⅰ 荧 光 定 量 PCR 检 测 方 法 。 Edvinsson 等（2006）[19]分别以 529 bp 重复序列和 B1 基因为靶基因建立荧光定量 PCR 方法，研究发现 529 bp（80 fg，DNA）灵敏性是 B1（800 fg，DNA）基因的 10 倍，80 fg的 DNA 相当于 1 个弓形虫的基因组 DNA。Yang 等（2009）[37]也以 B1 基因和 529 bp 重复序列为目的基因设计引物建立荧光定量 PCR，检测水样本中的弓形虫卵囊。Menotti等（2010）[38]根据 529 bp 序列设计Taq Man-AF-PCR 检测方法，同时与建立的 B1-PCR-ELISA 检测方法相比，144 份临床样本 B1-PCR-ELISA 检 测 出 的 72 份 阴 性 样 本 经 过 Taq Man-AF-PCR 可检测出 15 份（20.8%）为阳性；同时Taq Man-AF-PCR 比 B1-PCR-ELISA 提前 4～10 d检测到病原。Rahumatullah 等（2012）[39]利用 529 bp、ITS-1 和 B1 建立了三重 PCR 检测人体液中的弓形虫，同时发现三重 PCR 最低可检测到 10 pg 的弓形虫 DNA。赵东岳等（2013）[40]也以 529 bp 重复序列、ITS-1 序列和 B1 基因作为检测的靶基因，建立检测弓形虫的三重 SYBR GreenⅠ实时荧光定量 PCR 的检测方法并且与 ELISA 检测方法进行比较。ELISA检测猪弓形虫 IgG 抗体的阳性率为 41.72%，ELISA与荧光定量 PCR 检测核酸阳性符合率为 53.44%（P＜0.01）。表明建立的弓形虫三重 SYBR GreenⅠ荧光定量 PCR 检测技术具有高特异性和敏感性，可为临床弓形虫的诊断提供科学依据。通过以上文献报道，529 bp、ITS-1 和 B1 基因为靶基因建立荧光定量 PCR 已经显现出高敏感性。

3.3 聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）

谢德华等（2005）[41]通过对国内来源于不同宿主的 ZS 人株、sH 人株、cN 猪株、QH 绵羊株 4 个弓形虫虫株，以及国际标准强毒株RH株的致密颗粒抗原（GRA6）基因进行 PCR-RFLP 分析，结果证明中国人源弓形虫包含了Ⅰ、Ⅱ两种基因型，而动物源性弓形虫则因宿主和来源地不同亦有Ⅰ、Ⅱ两个基因型。Su 等（2009）[42]利用 10 个基因标记物建立了多重多位点巢式 PCR-RFLP 进行基因分型。Zhou 等（2010）[43]从来自湖北、河 南的 434 头病猪中分离出16 个弓形虫虫株，用 PCR-RFLP 方法鉴定出两个基因型。

3.4 原位 PCR（In Situ PCR，IS-PCR）

卢慎（2008）[44]应用免疫组化、原位杂交及间接原位 PCR 技术检测组织细胞中的弓形虫，结果表明弓形虫检测结果阳性率从高到低依次为间接原位PCR、原位杂交及免疫组化。

3.5 免疫-PCR（I-PCR）

李辉等（2006）[45]建立免疫-PCR 检测弓形虫抗原最低浓度为 0.1 ng/mL，I-PCR 检测弓形虫抗原灵敏度高于传统 ELISA 检测 6 000 倍，高于 ABCELISA 750 倍。

3.6 环介导等温扩增法（LAMP）

邹杰等（2008）[46]建立的弓形虫 LAMP 法能够检测出 10 个拷贝的目的基因，与新孢子虫等近缘原虫DNA 无交叉反应，且极大地缩短了时间。余传信等（2008）[47]依 据 弓 形 虫 的 B1 基 因 设 计 引 物 ，通 过LAMP 方法进行扩增，结果表明 LAMP 方法的敏感性是常规 PCR 的 10 倍。Sotiriadou 等（2008）[48]分别以 LAMP 和套式 PCR 方法对 26 个弓形虫的阳性水样进行检测分析，结果显示 LAMP 的检出率为100%，而套式 PCR 的检出率为 53.8%。Zhang 等（2009）[49]根据弓形虫 529 bp 重复序列进行 LAMP方法的建立，对疑似弓形虫感染的猪分别以常规PCR 方法和已建立的 LAMP 方法检测其淋巴结样本，结果显示 LAMP 检测的阳性率为 85.7%，而常规PCR 检测的阳性率为 76.9%，表明 LAMP 方法能够作为判断家畜是否感染弓形虫病的分子检测工具。王玉娇等（2014）[50]在建立猪弓形虫病 LAMP 检测方法的基础上，对采自延边地区的 264 份猪血液样本进行了猪弓形虫病的检测。结果显示延边地区是猪弓形虫病的流行地区，尤其家养散户型感染率高，而且仔猪的感染率高于肥育猪。曹利利等（2015）[51]在建立弓形虫 LAMP 检测方法的基础上，对采自吉林省部分地区的 423 份猪血液样本进行了猪弓形虫 病检测。结 果 LAMP 检测阳性 率 为 7.8%（33/ 423），说明吉林省部分地区仍是猪弓形虫病的流行地区。

3.7 核度探针技术

李华文（2004）采用随机引物法应用地高辛（DIG-11-dUTP） 标记探针并同基因组 DNA 进行Southern 杂交，表明 a-Tubulin 和 P-Tubulin 基因在弓形虫中高度保守。

4 小结

猪弓形虫感染途径多、传播方式广，且目前尚无特效治疗药物和方法。因此，加强养殖环节对该病的预防控制措施，提高猪产品中弓形虫检测技术水平，对减少其对养猪业的危害、降低其通过猪产品而致人感染的风险性，具有极其重要的意义。目前已应用于猪弓形虫病检测的方法很多，病原学方法结果最为可靠，但敏感性低且费时费力。常规的免疫学方法虽具有简易、快速等优点，但对于阳性结果的分析要慎重。以 PCR 为代表的分子生物学方法具有敏感、特异、检测迅速等优点，能直接反映现症感染，但存在假阳性、操作繁琐、需专用仪器等缺点。因此，只有结合各种方法的优缺点，猪弓形虫病检测方法才会得到更快、更好的发展。

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（编辑：郭玉翠）

Research Progress on the Detection M ethods of the Porcine Toxop lasmosis

ZHUANG Jinqiu,MEIJianguo,ZHANG Ying,YANG Limei,LIFeng,SHEN Zhiqiang
(Shandong Binzhou Animal Science&Veterinary Medicine Academy,Binzhou 256600,China)

Toxoplasmosis is a worldwide zoonotic parasitic diseases.It can cause miscarriage,stillbirth,child growth retardation and livestock fever,reproductive disorders,and cause great harm to the pig industry.There is no specific treatment drugs and methods for the porcine toxoplasmosis.It is the key of prevention and control of the disease by strengthening the breeding areas for the prevention of the disease controlmeasures,improving the level of detection of Toxoplasma gondii in pig products.It was reviewed the research progress on detection methods of porcine toxoplasmosis new laboratory in this paper,in order to provide reference for the veterinary scientific research workers and themajority of pig owners better of preventing and treatmenting this disease.

Toxoplasma gondii;Porcine toxoplasmosis;detection;research advance

S858.28

A

1002-1957(2017)03-0108-05

2017-03-14

山东省重点研发计划项目（2015GSF121027）；山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目（SDAIT-08-17）

庄金秋（1978-），女，山东潍坊人，副研究员，硕士，主要从事细胞培养和动物用病毒疫苗研制.E-mail：zhuangjinqiu2003@163.com