动物食品中磺胺类药物残留的分析方法

吴锁连，康怀彬， 李冬姣，张云霞，朱镝融

动物食品中磺胺类药物残留的分析方法

吴锁连1，康怀彬2， 李冬姣1，张云霞1，朱镝融1

（1.鄂州职业大学医学院，湖北鄂州 436000；2.河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳 471000）

磺胺类药物因价廉及抗菌谱广，主要用于动物饲料或治疗药物，但是不合理用药会导致磺胺类药物在动物组织中残留，影响食品安全，从而损害人类健康，因此对动物性食品的磺胺类药物残留检测十分必要。通过综述磺胺类药物残留的样品前处理及各种分析方法、适用范围等，为其检测方法奠定了基础。

动物食品；磺胺药物残留；样品处理；分析方法

0 引言

磺胺类药物（SAs）是以对位氨基苯磺酰胺为基本结构的衍生物，具有抗菌谱广、价廉稳定的特点，当和甲氧苄嘧啶、二甲氧苄嘧啶等抗菌增效剂协同使用，其抗菌谱扩大、活性提高，从抑菌变成杀菌作用，因此广泛应用于临床动物、水产养殖及饲料添加剂等研究领域[1]。

1 磺胺药物残留

从2005年起，农业部对动物产品的SAs残留予以重点监控。SAs被动物体吸收后，可转移到肉、蛋和乳等食品中，再通过食物链对人体产生副作用，主要表现在致癌、致畸、致突变等方面，王津涛等人[2]发现磺胺二甲嘧啶（SM2）在小白鼠连续给药中，会诱发甲状腺滤细胞腺癌，而且药物残留还会引起生态环境的污染，防碍畜牧业的发展。欧美大多数国家和我国规定动物源性食品中SAs的限定为总量不得大于 100 μg/kg[3]，日本为 20 μg/kg[4]。因此，对食品安全监测技术的研究提出要求，出现许多SAs测定方法。

2 样品前处理

样品检测前，需要将待测组分分离出来，避免样品中其他组分对目标分析物的干扰及对色谱仪的损害。早期样品前处理多采用液相萃取法，但是操作繁琐，且对于样品较复杂的水产品，仅用液相萃取难以去除其他干扰成分，液相萃取使用的一些有机溶剂也会影响动物蛋白活性，因此出现了新的萃取方法。

2.1 固相萃取

固相萃取（SPE）是由液固萃取和柱液相色谱技术联合发展，采用固体吸附剂选择性吸附目标化合物，再经洗脱达到分离、富集的作用，固相萃取简单快速、溶剂量少，但选择性不强，易将干扰物一同萃取。固相萃取仍是当前药物残留前处理的主要方法。常用的SPE柱有碱性氧化铝柱，Sep-Pak C18，Sep-Pak硅土柱，Bond Elut PSA柱，HLB柱，以及各种阳离子交换柱如MCX3，SXC，WCX等。吴黎明等人[5]采用Oasis HLB柱净化，高效液相色谱荧光法检测蜂王浆中8种SAs残留，最低检测限为10～50 μg/kg，回收率在 62.3%～74.8%。有学者对固相萃取方法进行改进，缩短了样品前处理时间，邬晨阳等人[6]采用C18柱净化，高效液相色谱（HPLC）法测定牛奶中7种SAs，检出限为1.3 μg/L，平均回收率为88.56%～91.65%。

2.2 基质固相分散技术

基质固相分散技术（MSPD） 是由美国的Barker S A等人[7]提出并阐明理论的一种萃取方法，将样品与C18柱填料混匀装柱，经洗脱后，将高极性杂质留在柱内。

与传统样品处理方法相比，MSPD具有省时、无乳化、样品和溶剂用量少等优点。MSPD适用于多种兽药残留分析，耿志明等人[8]采用基质固相分散技术提取净化，高效液相色谱（HPLC）测定鱼肉组织中7种SAs残留，检测限为0.02～0.03 mg/kg；Kishida Kunihiro等人[9]改进了MSPD法，采用中性氧化铝作为固相分散剂，HPLC法测定鸡肉中SM2等6种SAs残留，回收率大于87.6%。最低检测限6～40 ng/g，且检测时间小于1.5 h，溶剂12 mL。

2.3 超临界流体萃取

超临界流体萃取（SFE）是以超临界状态下的流体为溶剂，从样品中萃取出可溶性目标化合物的过程。美国通用食品公司最早将SFE技术应用于生产，Robert J等人[10]采用SFE萃取3种SAs含量，优化后条件为40℃，68 MPa，二氧化碳浓度1.042 g/mL，流速 2.5～2.71 L/min，持续 40 min，回收率 71.6%～96.9%。SFE具有快速高效、溶剂量少的优点，但设备昂贵，且无法适用于水样样品分析。

2.4 免疫亲和色谱法

免疫亲和色谱（IAC）是将抗体固定在载体基质上，通过抗体对抗原性物质的结合，进行分离纯化，纯化的样品可直接用于理化分析或免疫检测，而且IAC柱能再生。Jun Suo Li等人[11]采用IAC净化，HPLC/UVD测定了猪肉中的磺胺，检测限为0.001 μg/g。IAC是当前净化和富集能效最好的方法，但是非特异性吸附和大量纯化抗体的获取制约了该技术的进一步发展。

2.5 微波辅助萃取

微波辅助萃取（MAE）采用微波加热溶剂，将待测物从样品中分离并溶入溶剂中。通过微波加热强化，样品萃取的速度、效率和质量都有所提高。卢立泓等人[12]采用MAE净化，RP-HPLC测定鳗鱼中SAs残留，优化条件为45℃，5 min，800 W，采用微波萃取省时高效，且精密度、重复性和回收率也达到常规萃取法的要求。

3 分析方法

动物性食品中SAs的检测方法经过不断的研究和改进，目前主要分为微生物学法、免疫法及理化检测方法。

3.1 微生物学法

微生物学法是通过SAs对特异微生物生理机能和代谢的抑制性，从而对样品中SAs残留进行分析。检测方法包括四平皿法、拭子法、纸片法和Charm检测法。现已有商品化试剂盒ECLIPSE 50Delvotest SPKit，CopanTest（CHATK），CharmFarmTest，Charm AIM-96等。Braham R等人[13]采用对磺胺类药物敏感的嗜热脂肪芽孢杆菌接种到含溴甲酚紫和甲氧苄氨嘧啶的琼脂中，通过琼脂颜色和微生物生长抑制区来判定SAs含量，检测限接近最高残留量。微生物学法简便价廉，可用于大批样品分析，但是菌种不易筛选，易受抗生素干扰、特异性较差，不易定性或定量，无法满足微量抗微生物药残留的检测。

3.2 免疫分析法

免疫分析法起步于20世纪80年代，目标待测物与抗体结合的一种检测技术，常用的是酶联免疫吸附法，随着免疫相关技术的快速发展，生物传感技术、放射性同位素标记、表面等离子共振等分析化学技术与免疫技术相融合，产生的新的SAs残留免疫分析方法。

3.2.1 酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附法（ELISA） 是SAs残留免疫分析的主要方法，占90%以上[14]，在免疫酶技术的基础上发展而来，是采用酶标记技术与抗原抗体特异性结合的一种分析方法，根据酶催化底物的颜色来定量或定性。与高效液相色谱法、气质联用的理化分析结果接近，且操作相对简便，适合于现场和大批量样品的筛选分析，还可直接用于尿液、血液分析。杨红[15]用兔抗SM2抗血清测定牛奶、猪血浆和猪尿中SM2的酶联免疫吸附法，最低检出限为0.025 μg/L。我国在“十五”科技攻关期间自主研发了ELISA试剂盒，检测限10 μg/kg左右，达到国外同类产品水平。市场上有商品化的试剂盒，如Randox Sulfaquinoxline ELISA，Randox Sulfadiazine ELISA，Qflex Kit，Editek/Diagnostix Sulfaquinoxline Single Step ELISA等，但还没有研制出检测多种磺胺类药物残留的试剂盒。ELISA应用广泛，但酶不稳定、测定范围窄、难以完全自动化、检测时间较长等缺点也限制了该技术的应用。

3.2.2 放射免疫分析法

放射免疫法（RIA） 是最早建立的免疫分析方法，是将同位素标记技术与抗原抗体反应相结合的一种检测方法，主要用于SAs总残留量的检测。国外开发了一系列放射免疫试剂盒，美国Charm公司开发的Charm II和Charm II Sulfa Drug Test Kit应用最为广泛。林杰等人[16]参考Charm公司的资料，采用Charm II放射免疫法测定饲料中的SAs残留，检测限为100 μg/kg，60 min得出分析结果。此法提取简便快速、灵敏度高、检测限量低，可广泛用于药物、激素、细胞因子等化合物的定量分析中，但是由于其需要严格的放射性废物处理手段和特殊的实验室要求，限制了其进一步的发展。

3.2.3 胶体金免疫层析分析法

胶体金免疫层析分析法（GICA） 是在20世纪90年代发展起来的，采用胶体金颗粒作为标记物，运用于抗原抗体反应中，通过标记物聚集形成红色或粉红色斑点来定性或半定量[17]。Verheijen R等人[18]制得了磺胺二甲嘧啶胶体金检测试纸条测定稀释后的新鲜牛奶，检测限20 ng/mL，10 min内完成检测。GICA法简便灵敏，结果准确且易判定，可用于现场的SAs多残留的快速监测分析。

3.2.4 生物传感器免疫分析法

生物传感器免疫分析法（BIA）是免疫测试与生物传感技术的融合，将抗原（抗体）固定在膜或肌体传感器的表面，与相应的抗体(抗原)生成稳定的亲和产物后，导致膜或电极两侧电位改变，产生可检测的电信号。BIA具有很高的选择性与灵敏度，且可实现自动化，适于现场检测。Gaudin V等人[19]采用BIA测定牛奶中SM2残留，检测限为0.17 μg/kg，流速2 nL/min。1990年，Biacore AB公司开发出首台商品化SPR仪器，随着一系列SAs族特异性抗体的制备，为SAs多残留检测提供了新的途径，已经成功用于牛奶，猪肉等动物食品的SAs检测。

3.3 理化分析法

理化分析法常作为动物食品中SAs残留检测的确证方法，其中HPLC方法应用最为广泛，我国农业部采用HPLC/MS法[20]。其次是气相色谱法（GC）和薄层色谱（TLC），毛细管电泳（CE） 用的较少。仪器分析方法准确、灵敏度高，可同时测定多种药物，但是此类方法通常需要大量的资金投入，样品前处理繁琐费时，不适合现场大量样本的快速筛选检测。

3.3.1 高效液相色谱法

HPLC是采用极性固定相及弱极性流动相共同组成的色谱体系，是SAs残留检测的国际公认的分析方法，但在多种SAs残留检测时，有2～3种未分离的药物只能通过更换流动相才可以完全分离。陈振桂等人[21]采用HPLC测定鳗鱼、鮰鱼、龙虾中13种SAs残留，回收率为62%～97%，最低检测限0.02 mg/kg。有学者采用反相色谱法（RP-HPLC） 检测SAs残留，高智席等人[22]采用Sep-Pak C18柱净化，RP-HPLC测定肉牛组织中SM2含量，最低检测限为4.8μg/kg。相比于GC，HPLC分离能力强、样品不被破坏、易回收等优点。近年来，随着高效色谱柱、检测柱衍生化及计算机联用等技术的使用，HPLC的检测效率得到提高。超高效液相色谱（UPLC）就是在HPLC的基础上发展起来的分析技术，固定相粒径仅1.7 μm，因此具有较高的线速度、流速和反压，样品分离也更高效省时，峰容量更大，比HPLC分离效果更好。罗成江等人[23]按照农牧发[2001]38号动物性食品中SAs残留的分析方法，采用UPLC代替原HPLC测定猪肉中SAs残留，试验显示UPLC法在节省分析时间和溶剂用量上更有优势，采用UPLC提高检测精确度是未来发展的趋势。

3.3.2 气相色谱法

在早期的SAs残留分析中GC应用较多，1993年国标就采用GC测定食品中SAs残留。与HPLC相比，GC操作简单、检测器灵敏度高及检测限低，对样品净化要求较高，因此样品处理相对复杂，需要专业的操作人员分析，不适合一般实验室采用。在采用HPLC检测动物性食品中SAs残留后，GC逐渐被淘汰[24]。

3.3.3 薄层色谱法

薄层色谱法是利用不同组分对相同吸附剂吸附效果的不同，从而对样品进行分离、鉴定和定量的技术，具有特殊的选择性、无毒价廉、操作方便等优点。与GC和HPLC相比，TLC的自动化性、分辨率和重复性相对较低，但仍是一种有效的分离分析技术，经常作为样品的筛选方法。刘雪红等人[25]采用TLC测定鸡肉中SAs残留，试验显示分离良好，回收率为60%左右，检出限0.05 μg/mL。美国农业部食品安全局也曾采用TLC筛选SAs残留，Gerry J等人[26]用TLC检测沙丁鱼中SAs残留，检测限可达0.13 mg/g。

3.3.4 毛细管电泳法

毛细管电泳（CE）是根据各组分在高压电场的前提下，在毛细管中因迁移速度不同而实现分离，而且SAs有一定的水溶性、带电荷及紫外吸收等特点适用于CE分析。CE进样量小，柱效比HPLC还高，对样品的净化要求不高。与GC和HPLC相比，CE分离快速高效，且微量低耗。同时，CE进样量少，使其紫外检测的灵敏度受限，无法检测到低浓度的SAs残留，现在已较少使用。Lamba S等人[27]采用胶束电泳法检测牛奶中5种SAs残留，7 min内分离SAs，检测限为1.59～7.68 nmol/L，回收率为85%～114%。

3.3.5 联用技术

联用技术是将色谱的快速分离技术与质谱的结构鉴定技术相结合，既简化了样品的前处理，又实现了对目标化合物更准确的分析，目前主要采用气相色谱串联质谱（GC-MS） 和高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS）测定动物性食品中磺胺类药物残留。GC-MS法是SAs残留分析常用的确证方法，并且灵敏度高，但是样品前处理需要衍生化，除去分子中的极性基团。Anderw Cannavan等人[28]采用SCX柱净化，气相色谱串联质谱检测猪肉中的SMZ残留，检测限为0.001 μg/g。HPLC-MS特异性强及检出限低，且不用对样品进行衍生化，但是设备的采购及运行费用较高，暂时无法作为常规分析方法。Fuh Ming-Rens S等人[29]采用HPLC-MS测定动物组织中的SAs残留，检测限为0.01 μg/g。

理化分析方法中HPLC和GC的灵敏度高及特异性好，但是样品前处理复杂，回收率有时偏低，且需要使用大量有毒溶剂分离。HPLC-MS具有很好的准确性，但分析方法相对复杂、成本高，不利于普及。微生物学检测法应用较广泛，但特异性好的菌株很难筛选到，且与结构类似物有交叉反应，不适合同时检测多种SAs残留。TLC简单准确，但是灵敏度低及重复性差。CE微量低耗，灵敏性受限。

4 展望

综上所述，只有研制出灵敏高效的便携检测方法，同时实现对多残留同步确证的分析方法，才能有效地对动物源性食品中SAs残留进行监控，从法律角度加强对违法行为的打击，提高动物性食品的安全。

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Process for Analysis of Sulphoamide Residues in Animal Products

WU Suolian1，KANG Huaibin2，LI Dongjiao1，ZHANG Yunxia1，ZHU Dirong1
（1.School of Medical，Ezhou Polytechnic，Ezhou，Hubei 436000，China；2.School of Food Engineering and Biotechnology，He'nan University of Science and Technology，Luoyang，He'an 471000，China）

Sulfonamides are widely used in clinical veterinary medicine and animal husbandry for its broad-antimicrobial spectrum and low price.There is a risk of SAs residues remaining in animal products if these drugs have been administered improperly，abuse of SAs has generated potentially serious problems in human health and affected food safety.Therefore，it is necessary to study the residues of sulfonamides in animal products.The paper focused on the sample preparation and instrument testing methods of detection of the metabolites sulfa，including summarizing the characteristics of each detection method，scope.The article can be considered as a basis for the research on the most emcient determination methods.

animal products；residue of sulphonamides；sample preparation；analysis method

S859.84

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.10.046

1671-9646（2017） 10b-0058-04

2017-08-23

鄂州职业大学校级课题（2016YBA51）；湖北省教育厅科学技术研究项目（B2017531）。

吴锁连（1977— ），女，硕士，讲师，研究方向为食品加工。