胶体金免疫层析法检测水产品中药物残留的风险浅析

罗俊霞，李晓臣，范知，董素静，赵建波

（1.郑州市农产品质量检测流通中心，河南郑州450006；

2.郑州市农业信息中心，河南郑州450006；

3.郑州市园艺工作站，河南郑州450006）

胶体金免疫层析法检测水产品中药物残留的风险浅析

罗俊霞1，李晓臣1，范知2，董素静1，赵建波3

（1.郑州市农产品质量检测流通中心，河南郑州450006；

2.郑州市农业信息中心，河南郑州450006；

3.郑州市园艺工作站，河南郑州450006）

本文通过翻阅文献资料并结合日常的检测实际，分析胶体金免疫层析法快检产品应用于水产品中药物残留的检测时假阳性和假阴性的风险来源及产生的原因，提出相应的建议和应采取的措施，以期提高对水产品中药物残留的快速检测的效果。

胶体金免疫层析类速测产品；药物残留；假阳性；假阴性；风险来源

目前胶体金免疫层析技术已经较为广泛地应用于水产品中的药物残留（如氯霉素、磺胺类药物、氟喹诺酮类药物、孔雀石绿、硝基呋喃类药物）的速测产品中，这类产品在检测过程中具有快速、准确、操作方便、定量或者半定量[1,2]的特点，但是在检测过程中也存在着这样或者那样的问题影响着检测结果，造成假阳性或者假阴性检测结果的发生，严重影响了检测质量。为此笔者翻阅了大量的文献资料，结合平时的检测实际，以日常使用的水产品的快速检测试剂卡为例，浅析这类产品在检测过程中假阳性或假阴性发生的原因，供同行参考。

1 胶体金免疫层析法的技术特点

胶体金免疫层析法的优点有易制备、价格低、使用方便等特点；金颗粒大小可以控制，可进行双重或者多重标记，对组织细胞的非特异性吸附作用小，具有高特异性和高敏感性，既可以用于光镜，也可以用于投射电镜和扫描电镜；检测结果可以直接用颜色显示，肉眼判断直观可靠，也可配合其它方法进行定量和半定量[1,3-5]。但是该方法还存在着一些不足：（1）胶体金颗粒本身的特异性导致了该技术的应用存在一定的限制，如操作过程中需要的清洁度高；（2）某些胶体金颗粒稳定性差，存放时间短，渗透能力弱，着色不均匀等；（3）有些胶体金颗粒的检测灵敏度不高，检测限不能满足监控实际的需要[1]。

2 检测结果出现假阳性的风险来源

2.1 试剂盒的质量

试剂盒的质量是影响检测结果准确性的关键[6]，而影响试剂盒质量的最主要的因素是抗原抗体的质量，如果抗原抗体不具有高度特异性，则样品里与待检物质结构相似的物质则容易跟非特异性的抗原抗体发生交叉反应导致假阳性的检测结果[6-8]。胶体金试剂盒的特异性常用交叉反应率表示，与待测药物具有相似结构的物质都可能和抗原结合产生交叉反应，导致假阳性结果的出现[7]。赖年悦等[8]认为，待检样品种类繁多，成分复杂，容易影响抗原抗体反应以及胶体金颗粒与蛋白的吸附，有的抗体特异性不强，容易与目标物结构类似的物质有交叉反应，所以因样品基质不同，检出限在一定范围内波动，会造成假阳性的检测结果。用日常检测中使用的磺胺类药物的胶体金试剂卡对水产品中的磺胺类药物进行筛查，该产品可以检测如磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺异噁唑等12种磺胺类药物，也就是说该检测卡所使用的抗体并没有对这12种磺胺类药物中的某一种具有特异性的免疫反应，这12种磺胺类药物均可以跟该试剂盒的抗体反应，只是生产的抗体对这12种磺胺类药物敏感的程度不同，所以该试剂盒检测这12种磺胺类药物的最低检测限不一样。所以当阳性结果出现时，则说明该样本中可能含有高于该试剂盒里说明书中标明检测下限的12种磺胺类药物；或者该样品中含有12种磺胺类药物中的几种药物，只是含量未知。

2.2 基质效应

在痕量分析的过程中，样品或者样品提取物中及其复杂多变的蛋白质、碳水化合物、脂肪、其他的小分子物质及盐溶液会给检测结果带来较大的影响，叫做基质效应。在气相色谱检测农药残留方面，黄宝勇、罗俊霞等[9-12]做了大量基础性的研究，王秀丹[13]认为在免疫检测方面也存在较强的基质效应，也就是说样品里的非目标分析物也会引起较大的基质干扰效应，可能会和特异性的抗原抗体的发生非特异性结合，导致假阳性结果的产生。而李文玲等[14]认为，在用胶体金免疫层析法检测海参中的呋喃唑酮的过程中，由于其中蛋白和多糖组份的共同作用对检测性能造成很大影响，造成检测结果无法判定。

2.3 试剂盒的运输和保存

水产品的胶体金快速检测试剂卡受环境条件的影响较大，确切的说是抗原抗体受环境条件（如温度）的影响较大，不同的抗原抗体要求的贮存温度条件略有不同，一般环境温度需要控制在10℃左右，温度过高或者过低对抗原抗体都有影响，如果温度过高会使抗原抗体发生非特异性反应，导致假阳性检测结果的发生[6,15,16]。

2.4 结果判定

陶光灿等[17]对胶体金方法测定动物组织中的氯霉素的方法进行了改进，改进后的方法在检测过程中让金标抗体与待检样品液充分接触，增加了体系灵敏度，易于对样本中的药物残留进行分析，但是最后是通过颜色进行结果判断，比较主观，可能出现假阳性的检测结果。

3 检测结果出现假阴性的风险来源

3.1 试剂盒质量

在用胶体金免疫层析法检测水产品中各种药物残留时，试剂盒的质量是影响检测结果的关键。何华坚[18]对国内市场化的商品试剂盒和进口试剂进行比较，发现国产试剂盒存在质量不稳定、检测不准确等缺陷，很多产品抗原不稳定，如孔雀石绿抗原在产品保存期就失去了抗原的作用，使用这种试剂盒进行检测难免会出现假阴性的结果。

3.2 基质效应

王秀丹[13]认为在免疫检测方面，样品里的各种化学成份可能会影响到抗原抗体和目标分析物结合，降低竞争性免疫检测的灵敏度，灵敏度降低势必导致假阴性检测结果的发生。Mitchell等[19]针对不同的添加物和缓冲溶液对尿液中睾酮免疫的的影响做了系统的研究，发现尿液中的基质对睾酮检测结果有抑制作用从而导致检测结果呈现假阴性。而在基质效应的消除过程中很多人都采用将样品进行稀释的方法，但是在对样品进行的稀释的时候同时待测物质也得到了同样倍数的稀释，因此也降低了检测方法的灵敏度，引起假阴性结果的发生[13]。

3.3 反应的条件苛刻

用胶体金免疫层析法检测水产品的快速检测产品的前处理一般都比较简单，但是由于某些药物的特殊结构，需要将该物质转变为另外一种物质才能对其进行检测。例如水产品中硝基呋喃类代谢物的检测则需要将样品在65℃的条件下进行衍生30min，衍生成另外一种物质后才能对其进行检测，如果衍生时的温度恒温控制不好或者衍生的时间不够，就会引起衍生不完全，从而导致假阴性检测结果的出现。

3.4 样品的前处理过程复杂

一般在进行微量或者痕量分析时，称取样品的时候，为了提高样品中药物的提取效果，需要将样品粉碎成糜状，样品粉碎的越细，则样品颗粒的比表面积越大，提取的效果就会越好。目前使用快速检测卡进行检测时，由于样品量或者仪器配置的原因，粉碎、处理水产样品时，多数使用剪刀剪取一定量的样品，而没有将样品进行粉碎处理，这样大块样品进行提取处理，不易将样品里的药物提取出来，从而导致假阴性结果的出现。其次，在对样本进行药物的提取的过程中，往往进行均质或者涡旋，均质或者涡旋的目的也是将样本进行充分粉碎或者使有机溶剂和样本颗粒进行充分而有效的接触，从而提高提取的效果，假如这一步没有进行充分而有效的处理则样本中的药物就有可能不会完全提取出来，从而导致假阴性检测结果的发生。另外，在进行样品的浓缩之前，需要吸取一定体积的样品提取液，如果称取样品的时候使用的离心管体积较大（如50mL），因为该离心管较粗，往往在吸取的时候就取不够说明书上所需要的体积或者在吸取的时候吸到了水相，造成所浓缩的样本里药物的含量比实际样品中的含量低，从而导致假阴性的检测结果发生。最后在氮吹的时候氮气开的过大或者水浴锅的温度设的过高，则会导致目标药物随着有机溶剂的挥发而挥发，引起样本里目标检测物的含量降低，造成假阴性检测结果的出现；氮吹后需要用有机溶剂对试管壁进行充分的清洗和溶解，如果溶解不充分，也会造成样本里的目标药物损失，导致假阴性样本的发生。

4 检测过程中的注意事项

4.1 选用质量好的试剂盒

试剂盒质量的优劣直接影响检测结果的质量，所以，在检测过程中选用质量较优的试剂盒是必须的，必要时还应适时对试剂盒的质量进行验证、把关。刘欢等[20-22]对孔雀石绿、硝基呋喃类代谢物、氯霉素等三类药物多种产品的质量进行了比较和评价，认为孔雀石绿残留的胶体金快检产品稳定性较差，建议在用胶体金类快检产品应用于水产品的质量安全监管之前，有必要全面考察产品的质量，包括产品的稳定性。

4.2 加强研究，降低基质效应带来的检测风险

胶体金免疫检测中的基质效应是一个棘手的问题，目前国内外这方面的文献还较少，因此加大这方面的科研很重要。如果能够找到引起这种效应存在的根本原因，同时开发出有效、简便的消除基质效应的方法，将是胶体金免疫快检产品的重大突破。随着研究的不断进行，有望能够减小乃至消除胶体金免疫检测过程中的基质效应，使该产品真正实现在水产品安全品质监管方面的作用。

4.3 加强试剂盒在运输和贮存中的管理

因为胶体金快速检测卡有存放时间短的缺点，所以在试剂盒的运输和贮存过程中如果冷藏不好或者日常工作中反复冻融则会降低抗原抗体的特异性，导致试剂盒的灵敏度降低。因此在贮运过程中加强管理，或者减少试剂盒的流通中转环节，尽可能的减少试剂盒的库存量，从而提高抗原抗体的寿命，以减少假阳性或者假阴性检测结果的发生。

4.4 加强学习，提高检测人员的检测水平

快速检测工作看似简单，但是却细致而繁琐，不仅要求检测人员有一定的学历作为铺垫，而且要求检测人员应该具有化学分析的专业基础，经过培训考核，操作熟练规范，同时要求检测人员在检测工作中要细致认真，在工作中能够发现问题、分析问题、解决问题。所以，在日常工作中加强学习，提高检测人员的检测水平很重要。

4.5 在检测过程中做好质量控制，提高检测质量

对于在最后判定上面出现的检测误差，建议在检测过程中制备选取阴性样品，用阴性样品制备一定浓度的阳性样品，了解该产品阴性样品和阳性样品最终的检测效果，不仅对整个检测过程进行质量控制，也对最后结果的判定进行统一，提高最终的检测质量。

5 小结

随着现代科学技术的不断发展，免疫学、生物化学、分子生物学等技术应用于水产品中药物残留的快速检测方面的产品得到了长足的发展，以胶体金为代表的方法被全球很多先进的国家广泛使用，建立适合我国、快速、简便、特异性强、敏感度高，同时又准确可靠的水产品中药物残留的快速检测产品尤为重要。加强科学研究，提高检测结果的可靠性是检测领域的当务之急，这对加强水产品的安全品质，提高人民群众的身体健康、促进社会经济发展、维护社会的稳定有着重要的意义。

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Risk Analysis of Drug Residues in Aquatic Product by Colloidal Gold Immunoassay

LUO Jun-xia1,LI Xiao-chen1,FAN Zhi2,DONG Su-jing1,ZHAO Jian-bo3
（1.Agricultural Products Quality Inspection Center,Zhengzhou 450006,China;
2.Agricultural Information Center,Zhengzhou 450006,China;
3.Horticultural Workstation,Zhengzhou 450006,China）

Pass through document,find inform,combined with routine testing,the risk sources and causes of false positive and false negative were analyzed by using colloidal gold immunoassay for rapid detection of drugs in aquatic products，and corresponding suggestions and measures was taken.Expect to improve the effect of the rapid detection of drug residues in aquatic products.

aquatic product of colloidal gold immunoassay;drug residues;false positive;false negative;risk sources

X835

A

1005-3832（2017）02-0046-04

2016-09-21

罗俊霞（1972-），女，高级农艺师，学士，从事农产品安全品质检测研究.E-mail:71819@163.com

赵建波（1971-），高级农艺师.