菌种保藏方法及复壮技术

●食用菌栽培●

菌种保藏方法及复壮技术

10.16627 /j.cnki.cn22-1215/s.2017.06.022

菌种保藏的原理是通过干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等方法，使菌种的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存。需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、典型的形态特征、优良生产性能。目前常用的菌种保藏方法有以下几种。

1 菌种保藏方法

1.1 斜面低温保藏法

将需要保藏的菌种，接种在适宜的斜面培养基上，菌丝长满斜面时，用硫酸纸包扎棉塞，旋转在4℃的冰箱保藏。由于微生物的新陈代谢活动未停止，试管内培养基易失水变干，因此，保藏时间较短，转管次数多，不适于长期保藏。每隔六个月转管一次。草菇菌种不耐低温，需保藏在10～12℃，或在草菇菌落上灌注3～4毫升的防冻剂（10%的甘油）。如菌丝长满斜面后，在无菌条件下，用无菌橡皮塞代替棉塞，并用石蜡密封，即可在室温或冰箱中保藏。这种方法可防止杂菌污染，隔绝氧气，避免培养基干燥，使用方便。

1.2 液体石蜡保藏法

石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与空气接触，降低微生物代谢活性，使其处于休眠状态，因此能延长微生物的生命，保持菌种优良的种性。一般可保藏3～5年，是一种中长期的菌种保藏方法。

液体石蜡选用化学纯的，在121℃下高温灭菌30分钟，再将液体石蜡在160℃烘箱中保温1～2小时，蒸发掉液体石蜡中的水，或将高压灭菌后的液体石蜡放置在40～60℃温箱中，使灭菌后的液体石蜡层由乳白色变成无色透明。在无菌条件下，将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜面尖端1厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，直立地放在试管架上或罐头瓶中，置于冰箱或室温中保藏。液体石蜡灌注过多，移种时不方便；过少，时间长容易干涸。如将棉塞齐试管中剪平，用石蜡溶封，或用无菌橡皮塞代替棉塞，可延长保藏时间。

1.3 滤纸保藏法

在无菌条件下，用干燥的滤纸条收集孢子，然后用镊子将滤纸条及干燥硅胶放入试管中，并将试管放在真空干燥器中1～2天，除去滤纸条上水分，最后将试管口密封，贴好标签，置于冰箱保藏，或将滤纸条装入无菌塑料瓶中，密封保藏。保藏期限可达2～5年。

1.4 真空冷冻干燥保藏法

此法系将菌种同时处于低温、干燥和缺氧的条件下，使菌种的代谢活动相对静止，保藏时间可达数年或更长久。其方法是：将需要保藏的菌种或悬浮液，装在安瓿瓶里后，骤然冰冻，立即抽真空，使其快速脱水而干燥，再溶封后，置于低温或室温下保藏。复苏培养时，可在开启的安瓿管内注入0.3～0.5毫升的无菌生理盐水或1%麦芽汁。菌种安瓿瓶开启时，应先将安瓿瓶的封端加热，在浸有来苏尔等消毒液的湿布上擦一下，使管壁形成裂缝，然后再轻轻敲碎。切忌猛烈割断，以免空气骤然冲入，导致污染。

1.5 液态氮超低温保藏法

液氮超过低温保藏法是把菌种装在含有冷冻保护剂的安瓿瓶内，将该安瓿瓶放入液氮（-196℃）中进行保藏，由于菌丝体处于-196℃，其代谢降低到完全停止的状态。所以不需定期移植。液氮超低温保藏法是菌种长期保藏的最有效最可靠的方法。

1.5.1 菌种制备：菌种在PDA培养基平板上于22～24℃下培养10～15天，菌丝体充分生长后，用打孔器（直径2～4毫米）切割琼脂块，或用手术刀片把菌丝培养物切成2毫米×4毫米长方形小块。

1.5.2 安瓿管制备：安瓿管的玻璃，要能经受温度突变而不破裂，容易用火焰熔封管口，恢复培养时容易打开。一般采用硼硅玻璃管，管的大小根据需要而定，通常是75毫米×10毫米或能容1.2毫升液体的安瓿管比较合适。选好安瓿管后，用印油书写欲保藏的食用菌菌种的菌号于管壁上，160℃干热灭菌，使印记牢固地固定在管壁上。

1.5.3 保护剂：每管加进0.8毫升高压灭菌的10%甘油水溶液或10%二甲亚砜水溶液可作为冷冻保护剂。用无菌镊子将这种带有菌丝体的琼脂块移入加有保护剂的安瓿管中。用火焰将安瓿管上部熔封，浸在水中检查有无漏气。

1.5.4 液氮保藏：把已做好的安瓿菌种管放入具有孔洞的小塑料瓶中（在塑料瓶的底部放一块铁片，使塑料瓶连同安瓿管能一起沉入液氮罐中），盖好瓶盖，在瓶盖上连接一条细绳并作记号，以便提出所需的菌种。把装有安瓿管的塑料瓶吊在液氮罐口上，使安瓿管缓慢地降温，大约30分钟后，把安瓿管浸入液氮中进行长期保存。启用液氮罐中保存的菌种时，应先将安瓿管置于35～40℃的温水中，使瓶内的冰块迅速融解，然后在无菌条件下开启安瓿管，用接种针取菌块移接于适宜的培养基上，置于22～24℃条件下活化培养。

2 菌种的退化与复壮

2.1 菌种的退化

菌种在传代过程中，因遗传物质发生变异而引起的原有的优良性状渐渐消失或变坏，出现长势差、出菇迟、产量不高、质量不好、子实体丛生等现象。这些现象人们泛称为“退化”。“退化”是一个群体概念，既栽培中子实体群体中有少数子实体与亲本不同，不能算退化，只有相当一部分乃至大部分个体的性状都明显变劣，群体生长性能显著下降时，才能视为菌种退化。菌种退化是一个渐变的过程，在发生有害变异的个体在群体中显著增多以至占据优势时才会显露出来。因此尽管个体的变异可能是一个瞬时的过程，但菌种呈现“退化”即需要较长的时间。

2.1.1 菌种发生退化的原因：①菌种混杂：在菌种继代培养过程中，不同品种间交叉感染，导致不同品种的菌丝体混杂在一起，导致原有品种生产性状的改变，常常表现出产量下降、质量变劣等。②有害突变的发生：一般来说，一个正常菌株经过多代移植，不会导致遗传性状的改变。但是如果一个菌株的菌丝体细胞中发生有害突变，而且突变体能适应外界环境条件，那么，随着移接次数的增加，有害突变体在菌丝细胞群中所占的比例会逐渐增大。这样，该菌株的生产性能就会随之恶化，退化现象就逐渐显现出来。③病毒的感染：菌种感染病毒后，病毒不仅会随着菌丝体的扩大繁殖而增加，而且会通过带毒孢子传染下一代，当菌种携带一定浓度的病毒粒子，在栽培中都会表现出明显减产，菇质量下降等退化现象。

2.1.2 防止菌种退化的措施：①防止菌种的混杂：在菌种转管、出菇试验等工作中，均应加强品种隔离，减少品种间的混杂，以保证优良品种的遗传组成在较长时间内能保持相对的稳定。②控制菌种传代次数：菌种传代次数越多，产生变异的几率就越高，因此菌种发生退化的概率就会越多，生产中应严格控制菌种的移接代数。③采用有效的菌种保藏方法保存菌种：菌种保存应是短期、中期和长期三者相结合，根据不同的要求从不同保藏方法中进行转接，确保菌种能长期保持该品种的原有优良性状。④创造菌种生长良好营养条件和外界环境：菌种培养基的营养条件应适宜，才能使菌种生长健壮，减少退化的发生。营养不足和过于丰富对菌种生长均不利。菌种的生长繁殖受到物理、化学、生物等外界条件的影响，如条件适宜，菌种生长正常，不易退化；不相适宜，则会引起菌种的退化。⑤防止病毒感染：对菌种可能遭受病毒的感染应保持警惕。及时检验有疑问的菌种。淘汰感染病毒菌株，尤其是淘汰病毒粒子含量大、菌丝体及子实体性状已受到严重影响的菌株。

2.2 菌种的复壮

保持菌种的优良性状及生活力强的特性是保证食用菌优质高产的重要条件。为了避免食用菌优良性状的退化，必须采取复壮措施。常用的菌种复壮方法如下：

系统选育：生产中选择具本品种典型性状的幼嫩子实体进行组织分离，重新获得生长旺盛、活力强的双核菌丝。这种方法简便易行，周期短，生产上易于采用。反复进行无性繁殖，菌种会衰退，定期通过有性孢子分离和筛选，从中优选出具有该品种典型性状的新菌株，逐渐替代原始菌株，可不断地使该品种得到恢复。

适当更换培养基：长期在同一培养基上继代培养的菌种，生活力可能逐渐下降。在菌种保藏传代中，经常改变培养基成分，或在原有的培养基中添加酵母膏、麦芽汁、氨基酸类物质和维生素等，以刺激菌丝生长，提高菌种活力。

菌丝尖端分离：挑取健壮菌丝体顶端部分，进行纯化培养，以保持菌种的纯度，使菌种恢复原来的生活力和优良种性，达到复壮的目的。