真菌毒素免疫检测技术的研究进展

□ 王文珺 桑华春 北京智云达科技股份有限公司

真菌毒素免疫检测技术的研究进展

□ 王文珺 桑华春 北京智云达科技股份有限公司

真菌毒素，又称霉菌毒素，是指霉菌在其所污染的食品中产生的有毒代谢产物，可通过进食进入人或动物体内，引起人或动物的急性或慢性中毒，进而损害机体的肝脏、肾脏、神经组织等。

真菌毒素的特性及起源

真菌毒素，又称霉菌毒素，是指霉菌在其所污染食品中产生的有毒代谢产物，可通过进食进入人或动物体内，引起人或动物的急性或慢性中毒，进而损害机体的肝脏、肾脏、神经组织等。致癌性是真菌毒素对机体最严重和最普遍的危害。真菌毒素可在农作物生长或收获时形成，也会因贮存条件的不适宜而产生。湿度或温度高的环境通常有利于粮食和饲料中霉菌的生长及其毒素的产生。真菌毒素最早于1960年被发现，当时英国有10万只火鸡死于该种疾病，后来鸭子也被波及。科学家很快在花生饼饲料中发现了“罪魁祸首”：一种真菌产生的毒素，随后被命名为“Aflatoxin”。从此以后，科学家投入了大量的时间和精力研究真菌毒素，并发现其主要包括以下几个特点：

①低分子化合物：真菌毒素都是分子量小于1000的小分子化合物；

②对温度非常稳定，即使加热到340℃也不会被分解和破坏；

③抗化学生物制剂及物理的灭活作用；

④具有广泛的中毒效应；

⑤结构特异性：分子结构不同，毒性差异很大。例如黄曲霉毒素B1是毒性最强的真菌毒素，比砒霜毒性还强，但是仅改变其分子结构中的一个化学键，它的毒性就会显著下降。其实还有一个特点需要特别强调，就是真菌毒素在样品中的分布是不均匀的，因此分析过程中的取样方式和取样量非常重要，往往能够决定结果误差的范围。

目前，己确定的真菌毒素有400多种，常见毒素包括：黄曲霉毒素（AF，包括B1、B2、M1、M2）、玉米赤霉烯酮/醇（ZEN）、赭曲毒素（OTA）、T2毒素、呕吐毒素（脱氧雪腐镰刀菌烯醇，DON）、伏马毒素（FM，包括B1、B2、B3）等。其中黄曲霉毒素B1被认为是毒性最强的真菌毒素，也是粮食和饲料监测的重点。

真菌毒素的危害

据联合国粮农组织（FAO）统计，每年全世界大约有25%的农产品受到真菌毒素污染，其中约2%因污染失去价值，引起的损失达千亿美元。饲料及原料（粮食）中的真菌毒素污染对畜牧业影响巨大，美国因真菌毒素造成的损失达到14.4亿美元/年，我国损失则更大，达到150亿美元/年。由真菌毒素污染导致的食品质量安全问题已经引发社会的广泛关注，真菌毒素是导致粮食和饲料污染的重要原因，如果动物食用了被真菌毒素污染的饲料，也可能造成动物源性食品的污染。例如，奶牛吃了被黄曲霉毒素B1污染的饲料，它所产的牛奶中就会含有黄曲霉毒素M1。不仅如此，被黄曲霉毒素污染的饲料还会影响食用动物的健康。仍以奶牛为例，真菌毒素通过改变机体的新陈代谢和行为，导致奶牛产奶量降低，因饲喂受真菌毒素污染的饲料而造成产奶量减少是奶牛养殖场的常见现象。对奶牛产奶造成不利影响的真菌毒素主要是黄曲霉毒素和不同种类的镰刀菌毒素。黄曲霉毒素损害奶牛的肝脏组织，破坏肝脏功能，严重情况下会导致奶牛死亡。除此之外，黄曲霉毒素对猪的胚胎致死率高，致畸性强，易导致胚胎早期死亡被吸收、流产、弱仔，从而降低繁殖率。

概括来说，真菌毒素的危害性主要具有以下特点：其一为普遍性，即在谷物生产、储藏、加工阶段已经被感染，尤以玉米更为严重。二是隐蔽性—感官难以判断，除非已经发生颜色、气味等变化，隐蔽性毒素无法用常规物理方法判断。第三为微量性：低剂量即可导致畜禽或人患病。第四，蓄积性：一些真菌毒素如玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素等不易排出体外，会在体内蓄积达到中毒剂量。最后是协同性，表现为混合污染，协同作用，加大对人类、畜禽机体和生产性能的危害。

为了消除真菌毒素的危害，目前人们主要从两个方面着手：一是建立准确、快速、灵敏、多目标物的检测技术；二是研究发现真菌毒素的脱毒技术的研究。

国内市场真菌毒素快检产品现状

从“十五”起，食品质量安全问题就已引起了国家政府的高度重视，政府的重要工作会议都强调了食品质量安全的重要性。2015年10月1日实施的新《食品安全法》，加大了对食品质量安全的监管力度和惩治力度。同时，新《食品安全法》第一百一十二条规定：县级以上人民政府食品药品监督管理部门在食品安全监督管理工作中可以采用国家规定的快速检测方法对食品进行抽查检测。对抽查检测结果表明可能不符合食品安全标准的食品，应当依照本法第八十七条的规定进行检验。抽查检测结果确定有关食品不符合食品安全标准的，可以作为行政处罚的依据。以上，从法律层面肯定了快检可以作为一种执法手段，这也就对快检技术及产品提出了更高的要求。

经过我国政府十余年的努力，国产食品中的化学污染和残留已经得到有效控制，但是真菌毒素污染问题仍较为突出。真菌毒素对粮食、饲料、奶、肉、蔬菜、水果的危害已经到达令人触目惊心的程度，对真菌毒素的监测也已经引起国家相关部门的充分重视。在国家粮食局、农业部、国家食药总局等部门的监控计划中，都把食品中真菌毒素列为监测重点。2017年3月17日，国家食品药品监督管理总局发布的《食品安全国家标准食品中真菌毒素的限量》（GB 2761-2017）替代了GB 2761-2011。科技部“十三五”国家科技支撑项目也把真菌毒素检测及脱毒技术列为资助重点，为控制真菌毒素的社会危害提供技术保障。

目前，国内市场真菌毒素的免疫快检方法主要包括胶体金检测卡、酶联免疫检测试剂盒和时间分辨荧光免疫检测卡等，相关的快检仪器设备有酶标仪、胶体金读卡仪和时间分辨荧光检测仪。此外，还包括一些前处理方法和设备，如净化柱、免疫亲和柱等。国内有上百家食品安全快检公司能生产检测真菌毒素的快检产品，但产品质量良莠不齐，高质量的产品相对较少，造成的现实情况是真菌毒素快检产品在我国市场还无法完全实现本土化。一些权威检测和监管部门依然比较认同美国罗马（Romer）公司和Charm公司的产品。一个普遍的观点是，虽然国外产品价格比国内产品高50%甚至100%，但是其产品质量稳定、准确度高。事实上，国内自主研发的产品在质量上已经有所突破，在一些官方组织的产品比对实验中，甚至出现国产产品质量超过国外产品的情况，这可以说是国内真菌毒素快检行业的一大进步。但大的技术方向还是步国外技术的后尘，依然是模仿+超越的模式。其实从样本适用性和价格的角度讲，国内产品应该具有明显的竞争优势。这就需要国内的企业在质量上把关，提高核心技术优势，对真菌毒素的性质、危害及在粮食及饲料中的代谢动力学有充分了解，提早在产品研发上攻关，尽早完成市场培育，推动企业的核心竞争力，实现我国自主研发的产品对国内市场的覆盖，从而保障我国人民群众的生命财产安全，实现对粮食、饲料、奶、肉及水果、蔬菜的有效监管，

目前，国内市场真菌毒素的免疫快检方法主要包括胶体金检测卡、酶联免疫检测试剂盒和时间分辨荧光免疫检测卡等，相关的快检仪器设备有酶标仪、胶体金读卡仪和时间分辨荧光检测仪。

目前，国内市场真菌毒素快检产品的研发重点和难点问题主要集中在原材料的质量、产品的适用性、产品的性能、重点监测物这 4 个方面。维护我国对外贸易活动的正常进行。

真菌毒素免疫检测的关键技术点

技术创新点

目前，国内市场真菌毒素快检产品主要是基于抗原、抗体（不排除使用受体和配体）特异性反应的免疫快检产品。产品研发中的重点和难点问题主要集中在原材料的质量、产品的适用性、产品的性能、重点监测物这4个方面。

第一，抗原、抗体等原材料的质量。要了解原材料的重要性，需先了解抗体制备流程。真菌毒素属于小分子物质（分子量＜1000），其本身不具有免疫原性，需要与大蛋白偶联才能对机体产生免疫应答。如何将小分子的物质转变成免疫原？首先需要合成一个带有活性基团（一般是-COOH和-NH2）的碳链长臂，即半抗原。半抗原位点的选择与抗体的特异性关系极大，其与大的蛋白结合（比如牛血清白蛋白BSA、卵清蛋白OVA等）可获得免疫原和包被原。用免疫原免疫动物待效价和特异性达到要求，取动物抗血清获得多克隆抗体，如果不采血而是进一步取动物脾脏细胞、融合、克隆、培养上清和打腹水等步骤，将获得单克隆抗体。免疫动物的类型和免疫方法与抗体的亲和力关系较大，抗体的亲和性是抗体质量的一个重要参数。本项目研究中包括但不限于以下3点要特别关注—半抗原偶联的位点、免疫方式、单抗制备过程中的克隆和筛选。

在真菌毒素抗体制备方面，国内一些高校、科研机构及规模较大的食品安全检测试剂公司都在开展相关工作，其中不乏一些高特异性（或广谱性）、高亲和性的抗体。而且一些技术申请了国内专利，甚至有些科研机构抗体的制备方法还申请了国外专利，并把抗体卖到了国外多个国家和地区。好的原料来源是优质快检产品的充分必要条件，而高质量、稳定来源的抗原抗体是目前快检产品研发公司面临的最主要问题之一。抗体的特异性与匹配的抗原关系极大，稳定的抗原制备流程也是必须关注的重点。

第二，快检产品的适用性。国内真菌毒素快检产品没有覆盖国内市场的原因是产品质量不能完全满足检测要求，或者说国外的产品能更好地满足检测要求（准确性、便捷性）。比如Charm的胶体金检测卡，一条C线，两条T线，能够通过读卡仪实现准确定量。而国内胶体金检查卡，基本以定性检测为主，只有极少数厂家推出了胶体金定量检测产品，并将检测结果数据化，与食品安全的大数据管理相符合。包括北京智云达科技股份有限公司在内的少数公司选择了从另一个技术角度解决检测卡的定量问题，即时间分辨荧光检测技术。时间分辨荧光检测卡，检测的激发光在300~400nm之间，而发射光在600~650nm之间，受外部干扰少，所以稳定性较好，可更高效的实现定量检测。此外，荧光信号比胶体金的可见光信号更强，提高了检测技术的灵敏度，进而简化了前处理过程。

第三，产品的性能。在保证灵敏度的前提下，产品的性能涉及到两方面内容，即检测结果的稳定性和准确性。在产品研发过程中，有几个节点非常重要：第一节点是样本的选择，即样本的适用性。检测样本是产品研发过程中必然要进行的一个过程，而且产品的最终验证也要落实到样本检测上。首先，要有通过国标方法确定阴性和阳性的样本。一些快检试剂研发公司为了压缩研发时间，对于样本不愿意进行足够的投入，把从超市买来的样本默认为阴性样本，姑且不说超市的样本是否真的是阴性样本，连样本在存储过程中真菌毒素的变化情况都有待确证。第二节点是检测体系的稳定性。国外真菌毒素快检产品的稳定性优于国内产品，包括检测结果的稳定性和有效保存期内的稳定性。批间差是现有国内免疫产品尤其是真菌毒素胶体金检测卡的主要瓶颈，这是产品性能方面关注的第二个重要方面。