c-fos基因在麻醉药麻醉机理研究中的应用

■文/贵州大学动物科学学院 刘金平

c-fos基因在麻醉药麻醉机理研究中的应用

■文/贵州大学动物科学学院 刘金平

c-fos基因是一种存在于正常神经核内的原癌基因，具有高度保守性。c-fos基因当机体受到外界刺激时，c-fos基因便迅速表达，通过转录和翻译等一系列过程形成Fos蛋白。麻醉药的使用会影响中枢神经系统中c-fos基因的表达，可以根据c-fos基因的转录和翻译情况从基因和蛋白质的水平研究麻醉药的麻醉机理，这为麻醉药的研究提供了一个思路。

c-fos基因；Fos蛋白；兽用麻醉药

C-fos基因的研究可以追溯到20世纪80年代中后期，它是FBJ和FBR小鼠肉瘤病毒(MSVs)中病毒癌基因v-fos细胞同源序列。通过基因比对发现，人与小鼠的相同序列高达94%，非常保守。人的c-fos基因位于14q16～31，是一个包含4个外显子和3个内含子的DNA片段，其长度为9kb[1,2]。在受到外界刺激时，c-fos基因可转录为mRNA c-fos，进一步翻译为Fos蛋白。根据c-fos基因的特点建立了c-fos技术，就是利用机体受到刺激时c-fos基因表达量迅速增加和产物Fos蛋白堆积于细胞核内的特点，采用原位杂交、免疫组化和蛋白印迹等方法来研究神经元功能的技术。

随着畜牧业的快速发展，兽用麻醉药使用逐渐普遍。兽医临床手术中的应用最为常见，其能够减少动物在治疗过程中的痛苦，同时使动物处于安静状态，方便医务人员进行治疗[3]；麻醉药为野生动物体格检查和日常管理提供方便[4]；近年来，麻醉药应用于鱼类保活运输中，在长距离长时间运输过程中，外界的应激会导致肉质损伤[5]，甚至出现鱼类的死亡，合理地使用麻醉药可以降低鱼类的应激，减少鱼类的死亡率，MS-222(3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐)已被美国国家食品及药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准为渔用麻醉剂[6]，丁香酚作为一种麻醉剂，因具有价格低廉、对人体健康无害、休药期短、不会诱发机体产生突变物质等优点也被广泛应用在鱼类的运输中[7]。

麻醉药的使用带来诸多好处，掌握麻醉药在机体内的作用机理是麻醉药临床使用的前提，这可以为临床使用中出现意外提供合理解决方案。近年来，对兽用麻醉药作用机理的研究主要分为动物行为水平的研究、基因水平的研究、蛋白水平的研究等，本文就麻醉药使用后c-fos基因的表达情况进行探讨和分析。

1 c-fos基因

原癌基因家族中，有一类基因能够接收第二信使的信号，使细胞外刺激信号转化为调节细胞核内基因表达的信号，进行核内蛋白的编码，调节下游基因的表达，从而影响细胞结构、功能的改变，这类基因被称为“即刻早期基因”(immediate early gene，EG)，是目前较为理想的脑功能活动的定位标记[8]。这类基因在正常生理情况下表达量很少，但当机体受到外界刺激时能迅速表达、堆积形成蛋白，可以通过原位杂交或免疫组化等技术来进行研究。目前已发现的EG有十几种，按它们的结构和功能特征大致分为c-fos家族、c-jun家族、c-myc家族和egr家族[9]。目前研究比较多的是c-fos基因和c-jun基因。

c-fos基因普遍存在动物体内各组织器官中，且中枢神经系统分布最为广泛，参与脑各种活动的信号转导和调控过程[10]。具体的调节机制如下：第一类，Ca2+-钙调蛋白介导的信号转导途径、cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)磷酸化激活途径、甘油二酯依赖的蛋白激酶C(PKC)途径[11]；第二类，兴奋性氨基酸(EAA)受体和G-蛋白偶联受体(速激肽、肾上腺素能和α-MSH受体)诱导途径[12]；第三类，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体激活途径[13]；第四类，丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)途径[14]。

2 Fos蛋白

Fos蛋白是c-fos基因转录、翻译的产物。机体受到外界刺激时，c-fos基因被迅速激活转录形成c-fos mRNA，可在刺激30～45min达高峰期，12min为半衰期，编码形成由380个氨基酸组成的核内蛋白Fos，Fos蛋白可在刺激20～90min检测出来，60～90min达高峰期，持续时间为2～5h，半衰期为2h[15]。形成的FOS蛋白经过一系列过程完成细胞核内信号的转导，因此被称为核内“第三信使”[16]。

中枢Fos蛋白具有多种功能，常被用作神经元激活的标志。①FOS蛋白参与机体细胞的正常分化、生长以及中枢的学习、记忆等过程；②药物研究方面，目前已经有研究表明FOS蛋白的表达可以用于偏头痛、麻醉等种类药物的筛选、用药后的药效评价和疾病发病机理研究模型的建立；③在临床上，通常作为提示脑部受伤时间的参考指标，当脑部受伤时，根据FOS蛋白堆积的数量可以判断受伤时间；④FOS蛋白的表达还是细胞终末分化的标志及发生死亡的先兆[17]。总的来说，Fos蛋白的表达可以用于各个方面的研究，为科研工作者在蛋白水平的研究提供了一个思路。

3 麻醉药作用机理的研究概况

全麻药的作用机理有很多种说法，比较多的是“脂质学说”、“蛋白质学说”、“突触学说”等。近来的研究表明，全麻药的作用机理是多机制、多效应、多部位和多靶点的共同作用[18]，药物进入机体选择性的作用于中枢神经系统的不同部位或神经通路，主要的作用靶点包括受体、离子通道、酶等[19]，研究较多的NMDA受体[20]、神经烟碱受体[21]、GABA A受体[22～25]等，中枢神经系统cAMP信号转导通路、中枢神经系统NO-cGMP信号转导通路等，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶等。而对于局麻药和静脉麻醉药的作用机理还不太清楚，有待进一步研究。

4 c-fos基因在麻醉药作用机理中的研究概况

在麻醉药作用机理的研究中，c-fos基因已有较多报道。杨军等[26]在异丙酚麻醉大鼠实验中，运用反转录-聚合酶联反应(RT-PCR)和蛋白印迹技术(Western Blot)分析异丙酚对大鼠中枢神经系统海马各区c-fos、c-jun基因及蛋白表达的影响中发现，注射异丙酚后，大鼠的海马CA1区和DG区c-fos、c-jun基因和蛋白的表达水平显著升高，且随着异丙酚浓度的增加其升高趋势越明显，而海马CA3区未发现异丙酚对c-fos、c-jun基因和蛋白表达水平的影响，最终得出异丙酚可能通过影响c-fos、c-jun基因的转录和翻译，从而抑制中枢神经系统的作用实现麻醉功能，且此作用部位具有显著差异性。李小波[27]研究表明，小型猪复合麻醉剂及塞拉嗪对大鼠的大脑皮层、丘脑、脑干、小脑、海马5个脑区c-fos mRNA的表达有上调作用，从而推断5个脑区可能是麻醉药的作用部位，诱导c-fos mRNA的表达可能是小型猪复合麻醉剂及赛拉嗪的作用机制之一。孙凯[15]通过给大鼠腹腔注射不同剂量异丙酚发现，中枢神经系统内不同脑区Fos蛋白的表达发生变化，呈现剂量依赖性，推测异丙酚的麻醉作用可能与Fos蛋白有关，具体有待进一步研究。尹柏双等[29]给大鼠腹腔注射小型猪特异性麻醉剂(XFM)的拮抗剂阿替美唑，研究阿替美唑对大鼠催醒与c-fos基因的关系得出结论，中枢神经系统的c-fos基因参与XFM麻醉作用，拮抗剂阿替美唑诱导大脑皮层Fos蛋白的表达，可能是阿替美唑催醒XFM麻醉大鼠的重要机理之一。

5 c-fos基因在麻醉药作用机理中的研究展望

c-fos基因可以作为临床药物研究的观察指标，同时提供了药物研究的一些新思路。不管麻醉药的作用对c-fos基因的表达是抑制作用还是促进作用，都可以从两个不同的层面去思考麻醉机理。一是从c-fos mRNA方面，提取总mRNA，通过逆转录得到cDNA，运用RT-PCR得到扩增曲线和溶解曲线，比较麻醉前后c-fos mRNA的表达量，找出麻醉药对c-fos mRNA表达起抑制还是表达作用，再讨论麻醉药的作用机理。二是从Fos蛋白方面。目前这方面的研究已有报道，一些麻醉药使用后会促进Fos蛋白的形成，这时可以直接利用免疫组化或原位杂交技术确定Fos蛋白的表达量，也有一些麻醉药会抑制Fos蛋白的表达，这时可以借助外界刺激使Fos蛋白表达增加，一定时间后使用麻醉药，用上述的方法看麻醉药对Fos蛋白的抑制作用，分析麻醉药的作用机理。

根据上述两个方面的研究，麻醉药的作用机理存在两种可能性。①可能直接影响c-fos基因的表达，而如何影响c-fos基因的表达，c-fos又是如何发挥麻醉镇痛作用，这将是以后麻醉药作用机理研究的一个方向。②可能作用于某一受体，然后影响c-fos基因的表达，这时可以利用受体的激动剂或拮抗剂控制麻醉药的作用，观察c-fos基因的表达情况，当使用某一受体的激动剂或拮抗剂，c-fos基因的表达量发生变化时，就可以推测该麻醉药可能是作用于这一受体，具体如何作用还需进一步探讨。

6 结语

c-fos基因在兽用麻醉药麻醉过程中发挥重要作用，但c-fos基因如何参与麻醉过程、麻醉药物对中枢神经系统c-fos基因表达影响的具体机理等报道较少，没有形成系统的、清晰的思路，因此从c-fos基因方面研究兽用麻醉药的作用机理具有重要意义。明确麻醉药的具体作用机理，是研发一种新型麻醉药的必需过程，同时为寻找麻醉药合适的激动剂和拮抗剂提供帮助，激动剂和拮抗剂的使用可以更好地控制药物效果和作用时间长短；预防麻醉药使用过程中遇到的突发状况，提前制定合理方案。■

[1] 参李莉,余剑波,刘志学.针刺镇痛与c-fos基因的研究[J].临床麻醉学杂志,2011,27(10)：1030～1032.

[2] Xu KD, Liang T, Wang K, et al. Effect of preelectroacu puncture on p38 and c-Fos expression in the spinal dorsal horn of rats suffering from visceral pain[J]. Chin Med J (Engl), 2010,123：1176～1181.

[3] 冯秀娟,李忠生,祁文静.宠物麻醉药研究进展[J].中国工作犬业,2015(9)：17～19.

[4] 宋琳,丛晓楠,孙学军,等.麻醉剂在珍稀动物中的使用及体会[J].中国畜牧业,2016(8)：53～54.

[5] Zahi H, Kiessling A, Samuelsen OB, et al. Anesthesia induces stress in Atlantic salmon (Salmosalar), Atlantic cod (Gadusmorhua) and Atlantic halibut (Hippoglossushippoglossus) [J]. Fish Phy Biochem, 2010,36(3)：719～730.

[6] 苏明明,孙兴权,杨春光,等.渔用麻醉剂MS-222、丁香酚在鲜活水产品运输中的应用及检测方法研究进展[J].食品质量安全监测学报, 2015,6(1)：25～29.

[7] Mitrowska K, Posyniak A, Zmudzki A. Rapid method for the determination of tranquilizers and a beta-blocker in porcine and bovinekidney by liquid chromatography with tandem mass spectrometry[J]. Anal Chim Acta, 2009,637(1/2)：185～192.

[8] 覃启京,李发祥,欧阳升,等.c-fos基因与癫痫的相关研究现状[J].河南中医,2011(3)：311～313.

[9] 何海玲,邓春发,骆黎.c-fos与消化系疾病[J].中华全科医学,2011,9(3)：430～431.

[10] Makoto K, Todd A, Chunmei Y, et al. Neurotransmitter regulation of c-fos and vasopressin gene expression in the rat supraoptic nucleus[J]. Experimental Neurology, 2009,219：212～222.

[11] Angel B, Hélène M. Genetic approaches to investigate the role of CREB in neuronal plasticity and memory[J]. Molecular Neurobiology, 2011,44(3)：330～349.

[12] Wang J Q, Fibuch E E, Mao L. Regulation of mitogen activated protein kinases by glutamate receptors[J]. J Neurochem, 2007,100(1)：1.

[13] Yamg J, Woodhall G L, Jones R S. Tnic facilitation of glutamate release by presynaptic NR2B-containing NMDA receptors is incresed in the entorhinal cortex of chronically epileptic rats[J]. J Neurosci, 2006,26(2)：406～410.

[14] Hyun L, Hyun P. Matrix metalloproteinase-13 expression in L-1β-treated chondrocytes by activation of the p38 MAPK/C-Fos/AP-1 and JAK/STAT pathways[J]. Archives of Pharmacal Research, 2011,34(1)：109～117.

[15] 孙凯.腹腔内注射不同剂量异丙酚对大鼠脑内中枢Fos蛋白表达的影响[D].郑州：郑州大学,2011.

[16] 尹柏双,王秋竹,付连军,等.c-fos 基因功能及与麻醉关系的研究进展[J].中国兽医杂志,2014,50(10)：59～61.

[17] 涂冬萍,马小军,莫长明,等.FOS 蛋白的研究进展及生物信息学分析[J].湖北农业科学,2015,54(7)：1537～1542.

[18] 戴体俊.麻醉药理学的研究进展及发展前景[J].中国药理学与毒理学杂志,2015,29(5)：716～719.

[19] 罗竺欣,张宇,喻田.全身麻醉药靶点研究的新进展[J].临床麻醉学杂志,2015,31(6)：619～620.

[20] 陈向东,刘进.全麻原理研究新进展[J].中国继续医学教育,2010,8(12)：145～146.

[21] Diao S, Ni J, Shi X, et al. Mechanisms of action of general anesthetics[J]. Front Biosci (Landmark Ed), 2014,19：747～757.

[22] Zhou C, Liu J, Chen XD. General anesthesia mediated by effects on ion channels[J]. World J Crit Care Med, 2012,1(3)：80～93.

[23] Koyanagi Y, Oi Y, Yamamoto K, et al. Fast-spiking cell to pyramidal cell connection are the most sensitive to propofolinduced facilitation of GABA ergic currents in rat insular cortex[J]. Anesthesiology, 2014,121(1)：68～78.

[24] Stewart DS, Pierce DW, Hotta M, et al. Mutations at beta N265 in gamma-aminobutyric acid type A receptors alter both binding aff i nity and eff i cacy of potent anesthetics[J]. PLoS One, 2014,9(10)：e111470.

[25] Straub CJ, Lau HM, Parlato R, et al. Bidirectional regulation of intravenous general anesthetic actions by alpha3-containing gamma-aminobutyric acid A receptors[J]. Anesthesiology, 2013,118(3)：562～576.

[26] 杨军,沈磊.异丙酚麻醉对大鼠海马各区c-fos、c-jun基因及蛋白表达的影响[J].医学综述,2014,20(14)：2616～2621.

[27] 李小波.小型猪复合麻醉剂及赛拉嗪对大鼠不同脑区c-fos和c-jun基因表达的影响[D].哈尔滨：东北农业大学,2013.

[28] 尹柏双,石星星,李小波,等.阿替美唑对小型猪特异性麻醉剂诱导大鼠大脑皮质内Fos蛋白表达的影响[J].畜牧兽医学报,2012,43(5)：821～825.