基因编辑工具在植物中的应用

罗曦

摘 要：基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，相比锌指核酸内切酶（ZFN）和类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN），有着无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。植物在生长发育的过程中常遭遇各种物理、化学或生物性逆境，而阻碍其正常的生长发育，这对于农业生产有着极大的不利影響。本文通过对国内外多篇相关文献的研究，从基因编辑技术在多种植物中的作用，证明了CRISPR/Cas9技术在植物育种中有着广泛的运用，对于提高植物抗逆能力，具有良好的应用前景。

关键词：基因编辑 CRISPR/Cas9技术 定点突变 应用

1.基因编辑

基因编辑 （gene editing） 是对生物体的基因组及其转录产物进行定点修饰或者修改， 以改变目的基因或调控元件的序列、表达量或功能[1]。早期基因编辑技术包括归巢内切酶（HEs）、锌指核酸内切酶（ZFN）和类转录激活因子效应物（TALEN），但是脱靶效应或组装复杂性限制了这些技术在基因编辑领域中的应用。近年来，以CRISPR/Cas9系统为代表的新型技术使基因编辑的研究和应用领域得以迅速拓展。

CRISPR-Cas系统可分为3个不同的类型：I型、II型和III型，3个系统都包括目标DNA、靶向cr RNA和PAM[2]。其中，来自嗜热链球菌或化脓性链球菌的II型系统是用于基因组工程目的最多样化的[3]。CRISPR/Cas9技术的基本原理就是将核糖体RNA （r RNA） 设计为引导RNA。使引导RNA包含位于5'-端的靶DNA的互补序列以及位于3'-端的cr RNA的类似序列， 从而利用靶DNA的互补序列来定位需编辑的位点， 并通过cr RNA的类似序列与Cas9结合， 仅设计引导gs RNA就可实现对含有前间区序列邻近基序 （PAM） 序列的任一靶DNA序列进行敲除、插入与定点突变等修饰[4]。

2.CRISPR/Cas9技术在植物中的应用

2.1模式植物中的应用

拟南芥是进行遗传学研究的好材料，被科学家誉为“植物中的果蝇”。TCP基因家族是植物特有的一类转录因子，在植物生长发育过程中起重要的调节作用。为了探究月季TCP9基因对花器官发育调控的影响，以拟南芥为受体，应用CRISPR/Cas9技术构建植物双元表达载体，采用农杆菌介导的花序侵染法对拟南芥进行转化，并获得转化植株，转化植株表型变异明显，花瓣增多，雄蕊数目减少，雌蕊柱头弯曲，最后通过测序分析表明了月季TCP9基因对植物花器官发育调控有一定的影响[5]。

2.2农作物中的应用

水稻是稻属中作为粮食的最主要最悠久的一种，区别于旱稻。水稻所结子实即稻谷，稻谷脱去颖壳后称糙米，糙米碾去米糠层即可得到大米。世界上近一半人口，包括几乎整个东亚和东南亚的人口，都以稻米为食。为研究植物激素生长素在模式作物水稻中的功能，何先畅等[6]利用CRISPR/Cas9技术设计两个独立靶位点gRNAs对水稻的生长素合成基因YUCCA基因家族中的YUCCA1进行了一次性定点编辑，得到3种突变类型， 包括插入碱基A或T两种类型纯合突变， 一种杂合突变类型。通过分析，发现3种突变株系都存在移码现象而使氨基酸提前终止致使基因突变， 氨基酸的提前终止造成YUCCA1蛋白的失活。

棉花是世界上最主要的农作物之一，在我国作为重要的经济作物和纺织工业原料，原产于美洲芝加哥，十九世纪末叶始传入我国栽培。在棉花的生产中会面临许多病虫害以及干旱、盐胁迫的影响，导致减产或产品质量低下等问题。而基因编辑技术的应用则为培育生产优质棉花提供了技术保障。无法准确检测编辑的效应。因此采用先酶切后PCR方式编辑效应检测是一种有效可靠的方法。U6启动子作为CRISPR/Cas9基因组编辑系统的重要元件之一， 在李继洋等[7]的研究中，证明了基于棉花内源U6启动子的CRISPR/Cas9基因组编辑技术体系在海岛棉中的有效性， 表明该体系可以用于定向创制棉花的突变体， 为棉花功能基因组学研究提供了重要的技术基础。

2.3水果中的应用

柑橘类水果所含有的人体保健物质丰富，主要有：类黄酮、单萜、香豆素、类胡萝卜素、类丙醇、吖啶酮、甘油糖脂质等，有润肺、止咳、化痰等功效。研究表明柑橘溃疡病病原菌的效应因子PthA4进入柑橘基因组后，特异识别并结合在CsLOB1基因启动子上，调控寄主内CsLOB1的表达。在EBEPthA4附近创造更大片段的删除有利于提高突变体植株抗所有柑橘溃疡病株系的能力，利用CRISPR/Cas9技术，对CsLOB1启动子进行多位点编辑，以获得sgRNA区段之间发生删除的抗柑橘溃疡病的突变体植株。

葡萄为著名水果，生食或制葡萄干，并酿酒，酿酒后的酒脚可提酒食酸，根和藤药用能止呕、安胎。葡萄不仅味美可口，而且营养价值很高。传统葡萄育种是通过选择适宜的父母本进行杂交， 人工筛选优良性状的子代的方法既耗时又费力。2017年中国科学院植物研究所利用CRISPR/Cas9技术对葡萄酒石酸合成的关键酶基因进行了敲除， 成功降低了葡萄细胞中酒石酸的含量， 证明了CRISPR/Cas9技术在葡萄中的可行性， 这对未来葡萄育种、基因改良具有重要的指导意义。

3.展望

随着科技手段的不断进步，继传统的基因编辑技术的优化改良，CRISPR/Cas9技术应运而生。经过众多研究学者的不断探索实践，使得CRISPR/Cas9技术在植物的基因编辑领域有了广泛的应用，相信随着研究的逐渐深入，这项技术也将越来越安全成熟，将这项技术应用到植物育种中，能更好地实现优质生产，对人类的生活质量也能有更好地改善和提高。

参考文献

[1] 邢国杰，李桐，郑慧瑾，等.CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术及研究进展与应用[J].东北农业科学，2017，42（06）：28-30+35.

[2] 李翠，郝福顺，孙立荣.利用CRISPR/Cas9技术可有效沉默拟南芥NADK2基因[J].农家参谋，2018（16）：219-221+267.

[3] 谢磊，王姗珊，胡博文，等.基于CRISPR/Cas9技术的月季TCP9基因转化拟南芥[J].分子植物育种，2017，15（03）：928-933.

[4] 何先畅，黄国强，王道洋，等.利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得水稻OsYUCCA1基因突变体[J].基因组学与应用生物学，2017，36（11）：4778-4784.

[5] 杨海河，毕冬玲，张玉，等.基于CRISPR/Cas9技术的水稻pi21基因编辑材料的创制及稻瘟病抗性鉴定[J].分子植物育种，2017，15（11）：4451-4465.

[6] 何畅，姜玲，刘春林，等.甘蓝型油菜BnaSDG8基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建及功能探究[J].湖南农业大学学报（自然科学版），2018，44（04）：346-352.

[7] 李继洋，雷建峰，代培红，等.基于棉花U6启动子的海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑体系的建立[J].作物学报，2018，44（02）：227-235.