新型人感染H7N9型禽流感病毒研究进展

陈雅 综述，朱进，冯振卿 审校

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新型人感染H7N9型禽流感病毒研究进展

陈雅 综述，朱进，冯振卿 审校

2013年3月31日，中国疾病预防控制中心（CDC）正式公布3例人感染H7N9型禽流感确诊病例。经检测，这是一种新型禽流感病毒，本次是该类型病毒第一次被证实感染人类。首发的3例患者分别来自上海及安徽，此后该病迅速在中国大陆及港澳台地区蔓延，并呈现季节性流行趋势。该病发病迅猛，死亡率高。2013年11月，CDC正式将其纳入乙类传染病范畴并按照甲类传染病标准进行管理，按月通报流行状况。疾病发生后研究人员迅速对病毒来源、病毒特性、感染特征、检测措施及防治手段等方面展开调查研究。

1 新型人感染H7N9型禽流感病毒的流行病学特征

1.1 流行概况

2013年2月，新型H7N9型禽流感病毒感染病例起于华东地区，后蔓延全国。2014年及2015年均有两次流行高峰，发病高峰期为冬春季节，这与较低的气温更适宜病毒生存有关。患者年龄跨度广，性别及年龄分布有其独特性。

1.2 传染源与宿主

将患者咽拭子标本与呼吸道分泌物标本中分离得到的病毒基因与环境或家禽中得到的H7N9 型禽流感病毒基因进行对比检测，证实两者具有高度同源性。中国通过关闭禽类交易市场及扑杀可能感染的禽类，极大地降低了疾病的蔓延和发病率，这也从流行病学角度间接证明禽类为人类感染H7N9 型禽流感的主要传染源。此外，也有报道1例江苏病例，女儿密切接触父亲后6 d发病，并最终相继死亡。经基因检测，两人感染病毒高度一致，提示该病例有可能是由于密切接触患者的分泌物导致的人传人病例。

1.3 传播途径

流行病学证实，患者多有禽类直接或间接接触史，绝大多数病例均曾接触禽类。中国大陆地区尤其是农村地区多有活禽交易市场，粗放式的管理方式加剧了禽流感病毒的传播，进入市场购买家禽或从事相关工作均有可能感染。禽流感病毒也可通过环境传播，接触病毒污染的水源等可能致病。此外，目前报道的少数家族聚集性病例表明，病毒可能通过密切接触发生有限人传人，但尚未发现3人以上可能的聚集性病例。目前的检测结果提示，H7N9型禽流感病毒传播能力介于H5N1型高致病性禽流感和季节性流感病毒A（H3N2）之间。Zhang等利用从人体分离得到的H7N9禽流感病毒感染雪貂，可致该病在雪貂间通过飞沫传播，这表明病毒具备在哺乳动物之间发生飞沫传播的能力。

1.4 易感人群

病例对照研究发现疾病严重程度与年龄、基础疾病、免疫状况密切相关。患者多为老年人，且多有慢性支气管炎、高血压、糖尿病以及心肺疾病等基础疾病，有长期服用药物史。此外，患者约70%为男性，且大多居住于农村，这与农村中老年男性因工作或生活原因有更多机会接触禽蛋类商品及饲养禽类环境密切相关。

2 新型人感染H7N9型禽流感病毒的病原学特征

2.1 H7N9型禽流感病毒基因来源、重组与跨物种传播机制

CDC对最早确诊的3例患者体内分离的流感病毒株进行基因分析后发现，编码病毒血凝素（hemagglutinin，HA）的基因与鸭群中分离得到的H7N3型禽流感病毒株A/duck/Zhejiang/12/2011（H7N3）高度同源，编码病毒神经氨酸酶（neuraminidase，NA）的基因与韩国迁徙野鸟中发现的H7N9型禽流感病毒株A/wild bird /Korea /A14/2011（H7N9）高度同源，其余6个内部基因片段（PB2、PB1、PA、NP、M 及NS）与2012 年中国禽鸟中分离得到的A/brambling /Beijing /16 /2012 （H9N2）高度同源。该结果提示此次流行的H7N9 型禽流感病毒为重配新型病毒。随着更多病例的出现及深入研究，Wu等发现该病毒是由两次重配产生。第1次发生在欧亚起源的野鸟和中国野鸟之间，前者提供HA及NA基因，后者提供内部的6个基因，由此形成原始的H7N9型禽流感病毒。此后该病毒感染家鸟并与家禽中的H9N2型禽流感病毒于2012年初发生第2次重组，基因突变和后续的小型重组事件导致病毒的多样性，此外，发现基因突变导致该病毒在禽类中的适应性增强。由于新型H7N9禽流感病毒HA 酶切位点为EIPKGR* GL（*为酶切位点），提示其在禽类中的低致病性，因此新型H7N9病毒得以在禽类宿主中蔓延并获得适应及感染人类的机会。

2.2 H7N9型禽流感病毒关键位点突变

禽流感治疗中的一线药物包括M2 离子通道阻滞剂及神经氨酸酶抑制剂两大类。现已证实H7N9型禽流感病毒已发生S31N突变，这导致该病毒对M2离子通道阻滞剂耐药。约10%的H7N9型禽流感病毒对神经氨酸酶抑制剂耐药，这些病毒均发生R292K突变。人类呼吸道上皮存在两种唾液酸受体，包括含有α-2,3-半乳糖苷键的受体及含有α-2,6-半乳糖苷键的受体，α-2,3型受体常见于禽类呼吸道表面，更易结合禽流感病毒，而人类呼吸道表面更多见的是α-2,6型受体。HA上同时发生Q226L及G186V突变，较只有一个突变的病毒对α-2,6型受体结合的能力显著增加。此外，HA受体结合区150环发生T160A突变减弱了病毒与α-2,3型受体的结合能力，同样导致病毒结合人类受体的能力增加。病毒PB2蛋白上同时发生E627K及D701N突变导致聚合酶活性增强并使病毒在哺乳细胞中的复制能力显著上升，对小鼠的毒性显著增强以及在雪貂间的传播增加。

3 新型人感染H7N9 型禽流感病毒的特征

人感染H7N9型禽流感潜伏期一般≤7 d，轻症或早期患者表现为流感样症状，如发热、头痛，咳嗽、咳痰、咳血、肌肉酸痛等。后可迅速进展，表现为高热、重症肺炎、呼吸困难，部分患者可出现横纹肌溶解症、急性肾损伤、肝功能障碍以及脑病，严重者可表现为急性呼吸窘迫综合征、弥散性血管内凝血、休克、多器官功能衰竭综合征（multiple organ failuresyndrome，MOFS），甚至死亡。

胸部X线片及CT检查中，患者肺部改变最为突出，表现为单侧或双侧肺毛玻璃样改变、肺纹理增强以及多灶性肺实变，其中肺实变表现最为常见。此外还有胸膜腔积液、纵隔气肿以及继发的皮下气肿和气胸等影像学表现。

急性期患者血样实验室检查发现，血清中的趋化因子及细胞因子IP-10、MIG、MIP-1β、MCP-1、IL-6、IL-8 and IFN-α等显著增高，表明患者重症感染极有可能是由“细胞因子风暴”引起。患者白细胞计数正常或降低，中性粒细胞计数正常或升高。此外，住院患者可发生肺炎克雷伯菌感染、肺炎链球菌感染以及耐药鲍曼不动杆菌感染等，在死亡患者中尤为显著，因此感染特别是耐药菌的感染可能是致死原因之一。

病理解剖发现，患者肺内常表现为急性弥漫性肺泡损伤、肺泡间隔出血、弥漫性肺泡损伤后纤维化增生以及肺泡Ⅱ型上皮细胞胞浆及胞核核蛋白沉积，雪貂实验的肺部病理切片也出现相似表现。除典型的呼吸道病变，全身各器官均可受累，表现为脾淋巴组织萎缩，骨髓嗜血细胞现象，肾小管变性、坏死以及肝细胞空泡变性等，进一步证实发生MOFS。

4 新型人感染H7N9型禽流感病毒的检测手段

禽流感病毒的检测包括病毒的分离与培养以及血清学诊断等传统的检测方法和现代分子生物学检测。

4.1 病毒的分离与培养

收集患者痰标本、咽拭子标本等呼吸道分泌物标本并尽快送检，主要利用鸡胚或细胞进行病毒的分离培养。该检测阳性结果对明确禽流感诊断具有重要意义，但其周期长且操作复杂，不易在基层一线推广。

4.2 病毒的血清学检测

血清学检测主要基于特异性的抗原抗体反应进行。琼脂糖扩散（AGP）试验可用于鉴定A型禽流感病毒。血凝试验（HA）及血凝抑制试验（HI）可鉴别禽流感病毒表面的HA亚型，神经氨酸酶抑制试验（NI）可鉴别禽流感病毒表面的NA亚型。病毒中和试验具有良好的敏感性及特异性，在病毒鉴定及对照试验中起着重要作用。此外，ELISA 检测、免疫组织化学、免疫荧光技术等也是禽流感病毒检测的常用技术手段。

4.3 病毒的分子生物学检测

现代分子生物学技术大大拓展了禽流感的检测手段。PCR技术直接实现对核酸的检测，包括RT-PCR技术、荧光定量实时RT-PCR技术、多重实时荧光定量RT-PCR技术等在内的多种衍生技术已得到广泛应用。基因芯片通过将探针结合于固相载体表面，通过检测荧光标记的样品与探针的结合以同时检测样品中的大量核酸序列。最近兴起的高通量测序技术可短时间内对样品内十万至数百万未知基因分子进行精确测定。

5 新型人感染H7N9型禽流感病毒的防治策略

5.1 治疗药物

在禽流感一线药物中，新型人感染H7N9型禽流感病毒已对M2离子通道阻滞剂耐药，虽然目前神经氨酸酶抑制剂仍是H7N9型禽流感一线药物，但部分病毒已发生R292K耐药性突变，新型抗禽流感药物的研制迫在眉睫。

一种已被批准使用的天然干扰素Alferon N（IFN-α-n3）被发现具有抑制对神经氨酸酶抑制剂耐药的H7N9型禽流感病毒复制的功能。唾液酸酶融合蛋白DAS181（fludase）通过使宿主呼吸道上皮表面唾液酸受体失活，使得病毒HA 无法与受体结合，从而干扰病毒侵袭宿主的关键步骤。

Zhang等利用噬菌体抗体库技术研制出的单链抗体4F5以及利用杂交瘤技术研制出的IgG抗体8G10D7对多株H5N1型禽流感病毒有广谱中和作用，其结合血凝素HA1亚基保守抗原表位WLLGNP。最近Chen等也利用噬菌体抗体库技术研制出Fab抗体HNIgGA6和HNIgGB5，通过结合H7N9型禽流感病毒HA 的抗原结合位点186V和226L发挥中和作用。

已在临床上被批准用于恶性肿瘤骨转移性骨痛或癌性高钙血症的药物氨羟二磷酸二钠（pamidronate）可通过刺激Vδ2-T细胞发挥抗H7N9病毒的作用，抑制小鼠体内病毒复制与炎症反应，提高生存率。此外，中国传统中医药在禽流感治疗中的地位不容忽视。已有报道显示疏风清热胶囊、莲花清瘟胶囊、麻杏石甘汤、银翘冲剂、金花清感颗粒等多种中药对禽流感有效。

5.2 预防策略

作为新型禽流感病毒，H7N9 病毒缺乏特异性疫苗。世界卫生组织推荐A/Shanghai/2/2013（H7N9）和A/Anhui/1/2013（H7N9）作为H7N9禽流感病毒的疫苗候选株，用以研发特异性疫苗。目前正在研发的H7N9型禽流感疫苗包括如下几类：

5.2.1 全病毒灭活疫苗及裂解疫苗

2015年1月由Jackson等完成的A/Shanghai/2/13（H7N9）全病毒灭活疫苗的Ⅱ期临床试验表明，辅以AS03或MF59佐剂的疫苗在两剂注射后受试者血清抗体阴性转阳性率分别为84%和57%。此外，中国国家食品药品监督管理总局于2015年1月向华兰生物工程股份有限公司下发H7N9流感全病毒灭活疫苗及裂解疫苗药物临床试验批件，有望研制出国产特异性疫苗。

5.2.2 减毒活疫苗

在目前研发的减毒活疫苗中，Rudenko等利用A/17/Anhui/2013/61（H7N9）重组疫苗株研制的H7N9减毒活疫苗已于2014年成功进行Ⅰ期临床试验，两次免疫后诱发细胞免疫及体液免疫的比例达93%。

5.2.3 亚单位疫苗

Song等利用overlap-PCR技术将HA头部片段（HA1-2，aa 62-284）与TLR5配体fliC进行重组所表达HA1-2-fliC亚单位疫苗可在小鼠体内形成高IgG滴度并可至少维持3个月。To等制备的A（H7N9）-HA2与咪喹莫特佐剂共同注射，两剂后可对小鼠形成100%的保护，其认为该疫苗可能是通过Fc段介导ADCC效应发挥作用。而He等则发现血凝素茎部HA2的存在会减弱携带Fc段的HA亚单位疫苗的免疫原性，因此认为应避免其出现。

5.2.4 重组活载体疫苗

Kreijtz等以减毒Ankara病毒为载体，制备的MVAH7-Sh2疫苗可减少雪貂体内病毒复制，并减轻多种症状。Liu等利用反义基因工程技术将Anhui/1/2013H7N9禽流感病毒HA基因插入NDV疫苗株P和M基因之间，研制出的以新城疫病毒为载体的NDV-H7疫苗可诱发较高的血凝抑制抗体滴度。Cao等研发的鼻病毒载体疫苗HAd-H7HA在小鼠模型中可诱发CD4+T细胞和CD8+T细胞产生免疫应答。

5.2.5 DNA疫苗

Yan等成功利用DNA疫苗合成平台合成H7N9型禽流感DNA疫苗pH7HA，该疫苗对多株H7N9病毒血凝素均有较高的抗体滴度，在接受免疫小鼠体内可诱导大量效应T细胞和记忆T细胞的产生，对A/Anhui/1/2013（H7N9）病毒感染的小鼠保护率达100%。

6 结语

H7N9型禽流感目前仍为散发，但其大流行风险及高致病性应引起高度重视。需加强对其基因的监测以防范大范围人传人事件的发生。由于目前可有效抵抗该病毒的药物有限，且病毒突变速度快，因此需进一步深入研究该病毒特性并研发相应治疗药物。此外，针对H7N9型禽流感病毒的预防措施并不完善，应加快特异性疫苗的研发。♦

【作者单位：1. 南京医科大学病理学系；2. 南京军区军事医学研究所】

（摘自《医学研究生学报》2016年7期）