白念珠菌与生物膜相关的耐药机制

孟玲宁 刘锦燕 李文静 赵悦 项明洁

(1.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海 200025；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放免检验科，上海 200020)

·综述·

白念珠菌与生物膜相关的耐药机制

孟玲宁1,2刘锦燕2李文静1,2赵悦1,2项明洁1,2

(1.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海 200025；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放免检验科，上海 200020)

白念珠菌在医疗植入材料上形成生物膜,导致高死亡率感染。成熟的生物膜具有强耐药性,使得生物膜相关感染难以治愈。文章主要从白念珠菌生物膜外排泵基因、细胞外基质以及压力应答等3个方面探讨白念珠菌生物膜的耐药机制,综述该研究方向的最新进展,为白念珠菌的临床防治策略制定提供参考。

白念珠菌；生物膜；耐药机制；细胞外基质

白念珠菌是最常见的院内条件致病菌且经常导致血液感染，侵袭性念珠菌病最常见的危险因素是医用材料的植入[1]。常用于白念珠菌的抗真菌药物有唑类、多烯类、嘧啶类和棘白菌素类。近年来，临床抗真菌治疗失败的病例屡见不鲜，究其原因主要是白念珠菌对药物的耐药率增多和耐药性增强。

有研究发现,能够形成生物膜的白念珠菌,可以更有效地抵御抗真菌药物,使治疗更加困难。生物膜是由包裹在细胞外基质中的真菌细胞和假菌丝黏附于载体或者有机体表面而构成的立体结构，其作为一种屏障，可以避免内部菌落受到免疫系统的攻击，躲避抗真菌药物的杀伤作用，导致真菌耐药性的产生[2]。现就白念珠菌的生物膜对抗真菌药物的耐药机制作简单归纳。

1 外排泵基因

临床发现的唑类耐药分离株常常高表达相关外排泵基因CDR1、CDR2、MDR1，所以早期时研究者推测生物膜耐药表型是否也和外排泵活性增强有关。Mukherjee等[3]将早期、中期和成熟生物膜的耐药性进行了对比，实验发现，和亲本菌株相比，敲除了外排泵基因的突变株在成熟生物膜存在的情况下对于氟康唑的敏感性没有明显的变化，但在早期生物膜存在的情况下药物敏感性明显增强。刘东妹等[4]研究了在白念珠菌生物膜形成的不同时期，锌族转录因子TAC1以及外排泵基因MDR1、CDR1、CDR2与白念珠菌生物膜耐药的关系，结果发现TAC1和外排泵基因可能在白念珠菌生物膜形成的早中期对氟康唑的耐药发挥了一定作用。近年来发现FLU1基因编码的外排泵与人富组蛋白 (Hst5)的外排有关，Hst5是对白念珠菌有毒性作用的抗菌肽，最新研究发现，flu△/△突变株在Hst5存在的情况下生物膜的生成量明显减少，从而对药物的敏感性增加，但其中的机制还需要进一步的研究[5]。

2 环境压力

在白念珠菌黏附以及生物膜生长的过程中激活了一些应激反应，从而提高了真菌的耐药性。最早研究的是应对细胞壁压力而激活的信号转化通路MAPK。实验表明黏蛋白Msb2可以调控Cek1 MAPK通路，msb2△/△菌株能够形成正常的菌丝但是却有生物膜缺陷[6]。章珍珍等[7]发现Ras1是MAPK通路中重要的结合蛋白，RAS1基因缺陷株形成菌丝的能力下降，从而影响了生物膜群体的发展。随后的研究关注了细胞压力调节通路对生物膜耐药的影响，钙调磷酸酶属于Ca2+-钙调蛋白活化蛋白磷酸酶，有研究发现，环孢霉素A作为钙调磷酸酶的抑制剂，作用于含有生物膜的白念珠菌后，可以提高菌株对氟康唑的敏感性，由此可以猜测钙调磷酸酶在生物膜耐药的过程中发挥了一定作用[8]。白念珠菌压力应答通路中的成分热休克蛋白90 (Hsp90)，被认为是生物膜分散和耐药的关键调节因子。Robbins等[9]通过实验发现无论是体外还是动物模型中，通过基因或者药理水平破坏Hsp90的功能都能使生物膜由氟康唑耐药转变为敏感，但是Hsp90功能破坏后只是在很小的程度上影响生物膜的成熟，并不会破坏生物膜的形成。此外，Hsp90基因敲除会减少细胞外基质中葡聚糖的生成，主要通过影响β-1,3-葡聚糖合酶Fks1来调节葡聚糖的水平。Hsp90可以选择性地影响Zap1或者它下游的Gca1和Gca2从而调节细胞外基质的生成。

3 细胞外基质

生物膜内的细胞被包裹在自身产生的细胞外基质中，这是和浮游细胞的主要区别。细胞外基质的主要成分是碳水化合物、蛋白质和核酸[10]。虽然细胞外基质的作用还没有研究透彻，但先前的研究表明它在维持细胞环境稳态、防止生物膜分散以及逃避抗真菌药物等方面发挥了一定作用[11]。

有研究表明，细胞外DNA (eDNA)是细胞外基质中的一个重要组成部分，且随着时间总量在增加，使用脱氧核糖核酸酶I (DNAse)治疗后，生物膜总量随着时间在下降[12]。中性粒细胞针对浮游的白念珠菌可以分泌一些毒性物质NETs，如DNA、组蛋白来阻止白念珠菌的生长与扩散，Joohnson等[13]研究表明生物膜可以很大程度上抑制NETs的释放从而导致耐药，通过构建老鼠导管模型，发现编码细胞外基质甘露聚糖的基因PMR1的敲除可以引起NETs的大量释放，所以能够推测白念珠菌的生物膜可以通过细胞外基质抑制中性粒细胞释放毒性物质，从而介导多重耐药。

Nett等[14]研究表明，β-1,3-葡聚糖不仅存在于细胞壁中，也存在于细胞外基质中，同时总量会随着生物膜的成熟而增多。β-1,3-葡聚糖可以和氟康唑结合，从而阻止药物作用于生物膜相关的细胞。Nett等发现1 000 μg/mL氟康唑和1.25 U/mL溶细胞酶 (一种葡聚糖酶)混合作用于白念珠菌后可以降低生物膜的生存能力，而两者单独作用却没有这种效果。之后发现β-1,3-葡聚糖也可以和两性霉素B特异性结合而产生耐药。基于这些发现，此过程中的相关基因也受到了关注。首先是编码β-1,3-葡聚糖合酶的基因FKS1，实验发现，FKS1基因的杂合缺失突变株中β-1,3-葡聚糖的含量减少了30%，在经过250 μg/mL的氟康唑治疗48 h后，生物膜内细胞的生存能力下降了80%，而在浮游细胞中观察不到相关现象。Nett等[15]对FKS1基因进行调节，发现不论是抑制表达还是过度表达，都会影响生物膜对两性霉素B、棘白霉素和氟胞嘧啶的药物敏感性，联系之前FKS1基因与氟康唑的耐药关系，推测生物膜细胞中FKS1基因对于各类抗真菌类药物的作用机制是相同的，且此耐药机制可能是生物膜所特有的，因为破坏浮游细胞的FKS1基因对耐药没有任何影响。此外，控制细胞壁葡聚糖含量的PKC通路中的两个相关基因SMI1和RLM1，也被证实与细胞外基质中葡聚糖的含量有关，Smi1p调节FKS1的表达很可能是通过上游的转录因子Rlm1p[16]。Taff等[17]发现存在于细胞外基质中的两种葡聚糖转移酶 (分别为BGL2和PHR1基因编码)以及一种外切葡聚糖酶 (为XOG1基因编码)对于传递β-1,3-葡聚糖至基质中以及在基质中的聚集非常重要，缺少这些基因的生物膜相关突变株对于氟康唑的敏感性明显增加，而类似的现象却没有在浮游细胞中发现，实验观察到，bgl2△/△、xog1△/△、phr1△/△缺陷株和对照株相比，阻止放射性氟康唑进入的能力明显下降，这之中phr1△/△缺陷株对于氟康唑的药物敏感性增加最为明显 (近4倍增加)，这些缺陷株出现不同药物敏感性的原因还不是很清楚，仍需要进一步的研究。最新的研究表明，细胞外基质中的β-1,3-葡聚糖除了可以调控白念珠菌的耐药，还可以在大肠杆菌/白念珠菌联合的生物膜中使得大肠杆菌对于氧氟沙星的耐药性大幅度增加，而其中具体的机制还在研究中[18]。

4 其他机制

最新研究表明，凝集素样序列 (agglutinin-like sequence ALS)基因家族在生物膜早期形成和黏附中发挥重要作用，其中ALS1、ALS3基因的过表达可以使白念珠菌对氟康唑耐药性增加，但具体的机制仍需进一步研究[19]。Truong等[1]发现AHP1基因可以通过持续性的抗氧化作用来介导白念珠菌对两性霉素B的耐药，在二倍体的白念珠菌菌株中敲除AHP1基因后可以增加其对两性霉素B的药物敏感性。Mathe等[20]在研究中发现，白念珠菌在游离阶段对标准剂量药物反应敏感，但在附着和生物膜形成阶段对药物敏感性降低，在生物膜形成后，用PCR检测超氧化物歧化酶1 (SOD1)和过氧化氢酶1 (CAT1)的表达量都较之前增高，所以推测生物膜的耐药性与高抗氧化能力有关。Nobile等[21]现组蛋白脱乙酰酶复合物中的核心组成部分Set3复合物与白念珠菌生物膜耐药有关，Set3复合物突变株耐药机制既不是细胞膜完整性的改变，也不是上调了ABC转运蛋白超家族的表达，可能是生物膜内一些特有物质作用而产生的，特别是β-1,3-葡聚糖，但具体机制还没有被证实，需要进一步的研究。近几年的研究表明，免疫系统和生物膜相关白念珠菌细胞的关系与浮游细胞大有不同。Xie等[22]提出生物膜相关细胞的保护机制是由成熟生物膜完成的。实验发现，形成3 h的生物膜暴露于HL-60细胞 (一种人类中性粒细胞相似的细胞株)时，会失去80%的活性，而形成24 h和48 h的生物膜活性仅仅降低不到30%，与此同时，成熟生物膜的存在会抑制机体发生强烈的氧化应激反应，这通常是中性粒细胞杀伤致病菌的主要机制，而培养3 h的生物膜则相反，分散的生物膜也会产生氧化应激反应，引发人们对于细胞外基质在免疫系统中作用的研究。实验发现，细胞外基质并不会单独触发氧化应激反应，而葡聚酶作用后，细胞外基质抑制氧化应激反应的作用就消失了，而热灭活的葡聚酶以及DNA酶则不会出现此现象，这些结果提示白念珠菌细胞外基质中的β-1,3-葡聚糖在削减氧化应激反应中发挥一定的作用。

白念珠菌生物膜是临床上医疗植入物发生血源性感染传播的主要诱因,也是真菌耐药形成的重要因素,它的形成和耐药机制的复杂性决定了生物膜相关性感染的治疗极为困难。相对于其他耐药机制研究,生物膜相关研究起步较晚,仍然存在很多问题有待解决。基因芯片和分子生物学为其进一步研究提供了新的研究方法,为彻底治疗难治性感染和医院内感染带来新希望。

[1] Truong T,Zeng G,Qingsong L,et al.Comparative ploidy proteomics ofCandidaalbicansbiofilms unraveled the role of the AHP1 gene in the biofilm persistence against amphotericin B[J].Mol Cell Proteomics,2016,15(11):3488-3500.

[2] 张慧,孙红英.生物膜中白念珠菌的耐药性研究[J].中国感染与化疗杂志,2014,14(4):361-364.

[3] Mukherjee PK,Chandra J,Kuhn DM,et al.Mechanism of fluconazole resistance inCandidaalbicansbiofilms:phase-specific role of efflux pumps and membrane sterols[J].Infect Immun,2003,71(8):4333-4340.

[4] 刘东妹,满旭,李春莉,等.TAC1与外排泵基因对白念珠菌生物膜形成的影响[J].中国皮肤性病学杂志,2014,28(5):467-471.

[5] Li R,Kumar R,Tati S,et al.Candidaalbicansflu1-mediated efflux of salivary histatin 5 reduces its cytosolic concentration and fungicidal activity[J].Antimicrob Agents Chemother,2013,57(4):1832-1839.

[6] Puri S,Kumar R,Chadha S,et al.Secreted aspartic protease cleavage ofCandidaalbicansMsb2 activates Cek1 MAPK signaling affecting biofilm formation and oropharyngeal candidiasis[J].PLoS One,2012,7(11):e46020.

[7] 章珍珍,夏金萍,马鸣,等.白念珠菌RAS1基因高表达菌株的构建及鉴定[J].口腔生物医学,2016,7(2):72-75.

[8] Shinde RB,Chauhan NM,Raut JS,et al.Sensitization ofCandidaalbicansbiofilms to various antifungal drugs by cyclosporine A[J].Ann Clin Microbiol Antimicrob,2012,11:27.

[9] Robbins N,Uppuluri P,Nett J,et al.Hsp90 governs dispersion and drug resistance of fungal biofilms[J].PLoS Pathog,2011,7(9):e1002257.

[10] Borghi E,Borgo F,Morace G.Fungal biofilms:update on resistance[J].Adv Exp Med Biol,2016,931:37-47.

[11] Mitchell KF,Zarnowski R,Sanchez H,et al.Community participation in biofilm matrix assembly and function[J].Proc Natl Acad Sci USA,2015,112(13):4092-4097.

[12] Martins M,Uppuluri P,Thomas DP,et al.Presence of extracellular DNA in theCandidaalbicansbiofilm matrix and its contribution to biofilms[J].Mycopathologia,2010,169(5):323-331.

[13] Johnson CJ,Cabezas-Olcoz J,Kernien JF,et al.The extracellular matrix ofCandidaalbicansbiofilms impairs formation of neutrophil extracellular traps[J].PLoS Pathog,2016,12(9):e1005884.

[14] Nett J,Lincoln L,Marchillo K,et al.Putative role of beta-1,3 glucans inCandidaalbicansbiofilm resistance[J].Antimicrob Agents Chemother,2007,51(2):510-520.

[15] Nett JE,Crawford K,Marchillo K,et al.Role of Fks1p and matrix glucan inCandidaalbicansbiofilm resistance to an echinocandin,pyrimidine,and polyene[J].Antimicrob Agents Chemother,2010,54(8):3505-3508.

[16] Nett JE,Sanchez H,Cain MT,et al.Interface ofCandidaalbicansbiofilm matrix-associated drug resistance and cell wall integrity regulation[J].Eukaryot Cell,2011,10(12):1660-1669.

[17] Taff HT,Nett JE,Zarnowski R,et al.A Candida biofilm-induced pathway for matrix glucan delivery:implications for drug resistance[J].PLoS Pathog,2012,8(8):e1002848.

[18] De Brucker K,Tan Y,Vints K,et al.Fungal beta-1,3-glucan increases ofloxacin tolerance ofEscherichiacoliin a polymicrobialE.coli/Candidaalbicansbiofilm[J].Antimicrob Agents Chemother,2015,59(6):3052-3058.

[19] Roudbarmohammadi S,Roudbary M,Bakhshi B,et al.ALS1 and ALS3 gene expression and biofilm formation inCandidaalbicansisolated from vulvovaginal candidiasis[J].Adv Biomed Res,2016,5:105.

[20] Mathé L,Van Dijck P.Recent insights intoCandidaalbicansbiofilm resistance mechanisms[J].Curr Genet,2013,59(4):251-264.

[21] Nobile CJ,Fox EP,Hartooni N,et al.A histone deacetylase complex mediates biofilm dispersal and drug resistance inCandidaalbicans[J].MBio,2014,5(3):e01201-e012014.

[22] Xie Z,Thompson A,Sobue T,et al.Candidaalbicansbiofilms do not trigger reactive oxygen species and evade neutrophil killing[J].J Infect Dis,2012,206(12):1936-1945.

[本文编辑] 卫凤莲

The resistance mechanisms of the biofilm relatedCandidaalbicans

MENG Ling-ning1,2,LIU Jin-yan2,LI Wen-jing1,2,ZHAO Yue1,2,XIANG Ming-jie1,2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,RuijinHospital，ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200025,China;2.RadioimmunologyandClinicalLaboratory,LuwanBranch,RuijinHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200020,China)

Candidaalbicanscan form biofilms on medical implant materials,leading to high mortality infection.Mature biofilm relatedC.albicansinfections are difficult to cure because of multi-drug resistance.This review discusses the resistance mechanisms of biofilm relatedC.albicansfrom efflux pump genes and matrix and stress response,summarizing the research advance of the mechanism and providing reference for clinical prevention strategies.

Candidaalbicans;biofilm;resistance mechanism;matrix

124-127]

上海市科委基金 (15ZR1426900)；上海市医学重点专科 (ZK2012A21)；上海市黄浦区优秀青年人才 (RCPY1407)

孟玲宁，女 (汉族)，硕士研究生在读.E-mail:yimln16@163.com

项明洁,E-mail:mjxiang123456@126.com

R 379.4

A

1673-3827(2017)12-0124-04

2016-11-15