杂草抗药性及其机理研究进展

李健+李美+高兴祥+房锋+董连红

摘 要： 近年来随着除草剂的持续广泛使用，抗性杂草种群密度和发生面积逐步增加，杂草抗性问题已经是威胁我国粮食安全的重要问题之一。本文对我国目前杂草抗药性发生现状、抗性机理、转录组学技术在抗性杂草研究中的应用以及抗性杂草防除策略进行综述，以期为我国抗药性杂草的研究和治理提供一定参考。

关键词：杂草；靶标抗性；非靶标抗性；转录组学； 防除策略

中图分类号：S451.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）12-0165-06

农田杂草严重威胁作物产量，造成的经济损失巨大[1]。我国也是遭受杂草危害最为严重的国家之一，2005和2006年我国受杂草危害面积均在7 000万公顷左右，每年由杂草危害直接造成的粮食损失达238万吨，直接经济损失接近1 000亿元左右[2]。我国有1 400多种杂草[3]，列入名录的农田杂草有704种，属87科366属[4]，对农业生产造成危害的重要农田杂草有60多种[5]，其中恶性杂草包括野燕麦（Avena fatua）、看麦娘（Alopecurus aequalis）、马唐（Digitaria sanguinalis）、狗尾草（Setaria viridis）、牛筋草（Eleusine indica）、柳叶蓼（Polygonum bungeanum）、反枝苋（Amaranthus retroflexus）、香附子（Cyperus rotundus）、白茅（Impevata cylindrica）、稗草（Echinochloa crusgalli）、异型莎草（Cyperus difformis）、鸭舌草（Monochoria vaginalis）、眼子菜（Potamogoton distinctus）、扁秆藨草 （Scirpus planiculmis）等[6]。杂草种群内，个体的多实性、易变性、多型性及对环境的高度适应性和遗传多样性是产生抗药性的内在因素[8-11]，而除草剂的长期和单一使用会诱发抗性个体的产生，并对其加以筛选[12，13]。同时，近些年来，随着除草剂的持续广泛使用，抗性杂草种群密度和发生面积逐步增加[7]。抗性杂草的存在使得相应除草剂的防治效果降低，选用除草剂难度增加，除草剂复配组合种类、剂量增加，这些不仅增加了杂草防治成本，造成作物产量损失，也易造成农作物药害风险和环境污染。目前，杂草抗性问题已经是威胁我国粮食安全的重要问题之一。本文重点介绍了目前杂草抗药性发生现状、抗性产生机理和减缓杂草抗药性的措施等内容，以期为后续杂草抗性研究提供理论参照，为我国抗性杂草的综合治理提供参考。

1 杂草抗药性发生现状

自20世纪50年代在加拿大和美国分别发现抗2，4-D的野胡萝卜（Daucus carota）和铺散鸭跖草（Commelina diffusa）以来[14，15]，全球抗药性杂草生物型一直呈上升趋势。根据国际抗性杂草调查网站[7]发布的数据，截至2016年8月在其网站上登记的抗性杂草包括共250种杂草（其中单子叶杂草145种，双子叶杂草105种）的471个抗性个体（图1）。

据统计，已经登记的抗性杂草对23类不同作用方式除草剂中的160个产品产生了抗性[7] 。根据除草剂作用方式和使用量的不用，目前主要抗性杂草种类包括以下几类（图2）：

①抗ALS（acetohydroxyacid synthase，乙酰乳酸合成酶）抑制剂类除草剂杂草，ALS抑制剂类除草剂是已报道抗性杂草最多的一类，目前共有158种杂草对这类除草剂产生了抗性。早在1982年，澳大利亚（www.weedscience.org）就报道了首例抗氯磺隆的硬直黑麦草（Lolium rigidum）[16]。

②抗PSⅡ（inhibition of photosynthesis at photosystemⅡ，光系统Ⅱ抑制剂类除草剂）抑制剂类除草剂杂草数量紧随抗ALS抑制剂类除草剂杂草之后，其中抗莠去津杂草已经达到73种（其中双子叶杂草50种，单子叶杂草23种）[7]。

③抗ACCase（acetyl CoA carboxylase，乙酰辅酶A羧化酶）抑制剂类除草剂杂草，该类抗性杂草在数量方面仅次于前两类，约50种杂草对该类除草剂产生了抗性。

④抗EPSP（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSP合酶）抑制剂类除草剂杂草，抗该类除草剂的杂草近些年呈现快速增长的趋势，目前抗性杂草数量已经位于第四位。

除了以上提到的几类抗性杂草，还包括抗PPO（protoporphyrinogen oxidase，原卟啉原氧化酶）抑制剂类除草剂杂草、抗PDS（carotenoid biosynthesis inhibitors，类胡萝卜素生物合成抑制剂）抑制剂类除草剂杂草、抗HPPD（4-hydroxyphenyl-pyruvate-dioxygenase，对羟基苯基丙酮酸双氧化酶）抑制剂类除草剂杂草、抗生长素合成（synthetic auxins，生长素合成）抑制剂类除草剂杂草和抗DHP（dihydropteroate，二氢叶酸）抑制剂类除草剂杂草等。

截至目前，抗性杂草已经为害到全球范围内66个国家的近86种作物，从抗药性杂草的分布看（图3），绝大多数抗性杂草种群都分布在除草剂应用水平较高的发达国家，但是这并不意味着我国就处在一个绝缘的地域内[17]。

自1980年在我国台湾省发现抗联吡啶类除草剂百草枯的苏门白酒草（Conyza sumatresis）以来，中国已报道了41种杂草对不同除草剂产生了抗药性，并且一些杂草已经对多种除草剂同时产生抗性[7]。其中已发现抗1种或多种ALS类除草剂的杂草包括雨久花（Monochoria korsakowii）、野慈姑（Sagittaria montevidensis）、播娘蒿（Descurainia sophia）、猪殃殃（Galium aparine）、荠菜（Capsella bursapastoris）、田紫草（Lithospermum arvense）、鹅肠菜（Myosoton aquaticum）、鸭舌草（Monochoria vaginalis）、马唐（Digitaria sanguinalis）、稗草（Echinochloa crusgallivar）、野蔊菜（Rorippa indica）、看麦娘（Alopecurus aequalis）和日本看麦娘（Alopecurus japonicus）等；属于ACCase抑制剂类除草剂抗性的杂草包括日本看麦娘（Alopecurus japonicus）、稗草（Echinochloa crusgalli）、看麦娘（Alopecurus aequalis）、菵草（Beckmannia syzigachne）、硬草（Sclerochloa kengiana）、千金子（Leptochloa chinensis）、马唐（Digitaria sanguinalis）、棒头草（Polypogon fugax）等；属于PSⅡ抑制剂类除草剂抗性的杂草包括日本看麦娘（Alopecurus japonicus）、反枝苋（Amaranthus retroflexus）等。除了以上抗性杂草外，还有多种对其它类除草剂产生抗性的杂草陆续被发现。

2 杂草抗药性机制

随着抗性杂草的大量出现，对于杂草抗药性机理的深入研究变得越来越迫切。目前已经研究和阐明的杂草抗药性机理主要包括：靶标抗性和非靶标抗性机制[18]。由于靶标基因确定，易于鉴定，因此对于靶标抗性的研究目前开展得较多，研究较为透彻；而受制于杂草基因组序列资源的匮乏，对于同样非常重要的非靶标抗性则开展较少，而这也是亟待开展的方面[20，35]。

2.1 靶标抗性（target-site herbicide resistance，TSR）机制

绝大多数除草剂作用于杂草体内专一的靶标酶，由于单一靶标除草剂的长期、频繁使用，使得目标杂草长期面对一定的选择压力，靶标基因功能位点发生氨基酸水平的突变会导致靶标酶活性的变化，这是导致杂草产生靶标抗性的主要原因[9，19，20]，而有靶标基因功能位点突变的植株被选择和保留下来[21]，从而导致了抗性杂草的逐年增加。

部分学者认为杂草靶标基因内功能位点发生突变，导致其和除草剂的亲和能力下降，除草剂药效降低甚至防治失败，这是抗药性杂草生物型（尤其是高抗生物型）出现的主要原因[18]。例如，PSⅡ抑制剂类除草剂的抗性与psbA基因位点突变有关，该基因编码PSⅡ复合体中的D1蛋白。当前研究发现，D1蛋白第219、264和268位点氨基酸发生突变是导致杂草对PSⅡ抑制剂类除草剂产生抗性的主要原因。例如莠去津抗性杂草是由于D1蛋白264位点丝氨酸被甘氨酸取代所产生的[22]。

ALS类除草剂是主要通过抑制ALS酶的活性来达到杀死或抑制杂草生长的一类除草剂，目前全球发现并报道的抗ALS抑制剂的杂草中，共有8个氨基酸位点发生了突变。以拟南芥为参考系，这些突变位点在氨基酸序列的位置分别为：122位点丙氨酸（Ala122）被苏氨酸、缬氨酸或酪氨酸取代；197位点脯氨酸（Pro197）被组氨酸、苏氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺取代；205位丙氨酸（Ala205）被缬氨酸取代；376位点天冬氨酸（Asp376）被谷氨酸取代；377 位精氨酸（Arg377）被组氨酸取代；574 位点色氨酸（Trp574）被亮氨酸或甘氨酸取代；653 位点丝氨酸（Ser653）被苏氨酸、天冬酰胺或异亮氨酸取代；654 位点甘氨酸（Gly654）被天冬氨酸取代，这些位置的氨基酸发生突变使得杂草对相应的ALS类除草剂产生了不同程度抗药性[23]。

一般同一靶标基因内不同位点的突变也会导致不同抗性的出现，例如ALS基因内Ala122、Ala205、Trp574、Ser653和Gly654的突变可使杂草对咪唑啉酮（imidazolinones，IMI）类除草剂产生抗性，而对磺酰脲类（sulfonylureas， SU）除草剂则没有或仅少数杂草产生抗性；而Pro197的突变可使杂草对SU类除草剂产生显著抗性，而对IMI类除草剂则没有或仅少数产生较低的抗性。靶标基因内同一位点的突变在不同杂草内也会造成不同的抗性水平，例如硬直黑麦草（Lolium rigidum）内Pro197（Pro-197-Ser/Arg/Ala/Leu/Gln）位点的突变导致其对SU类除草剂产生显著抗性，对IMI类除草剂则没有抗性；而异型莎草（Cyperus difformis）内Pro197（Pro-197-His）位点的突变则同时导致其对SU类和IMI类除草剂产生了抗性。而且，随着单一类除草剂的持续使用，具有一个以上突变位点的抗性杂草也呈现逐渐增多的趋势[18]。

靶标酶基因表达量的变化也是靶标抗性产生的另一个重要方面[18]，如5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）是草甘膦的作用靶标，研究表明大肠杆菌E. coli细胞过量生成5～17倍的EPSPS，对草甘膦的抗性至少增加8倍[24]。

2.2 非靶标抗性（non-target-site herbicide resistance，NTSR）机制

非靶标抗性机制是尽量减少活性除草剂到达目标部位的数量，从而减少除草剂对杂草的损伤。主要包括杂草对除草剂的渗透、吸收和传导减少，代谢解毒作用增强以及对除草剂的屏蔽或隔离作用等[25]。

其中代谢解毒机制（代谢抗性）是一种最常见的杂草非靶标抗性机制，通常是由细胞色素P450单加氧酶（P450s）、谷胱甘肽S型转移酶（GSTs）和/或其它酶系的活性增强引起的[18]。P450s和GSTs是在植物体内的初级和次生代谢过程中发挥重要功能的家族酶，它们中的一些酶参与了除草剂的降解过程，是杂草代谢抗性产生的重要机制[26-32]。例如，一些P450s能够促进除草剂芳基羟基化或烷基羟基化，GSTs能够催化谷胱甘肽轭和而导致相应除草剂的活性丧失[20]。Gronwald等[33]研究发现苘麻（Abutilon theophrasti）对莠去津产生的抗性机理是由于谷胱甘肽与除草剂轭和作用的增加，进而提高了对除草剂的解毒能力；而大穗看麦娘（Alopecurus myosuroides）体内P450s活性的增强，使其同时对ACCase 和PSII抑制剂类除草剂产生了抗性[31]。

Dinelli等[34]研究表明，意大利两种黑麦草（Lolium spp.）对禾草灵产生抗性的原因是杂草对除草剂的屏蔽作用或对作用位点的隔离作用使除草剂不能到达其作用位点，从而不能杀死黑麦草。

3 减缓杂草抗药性的措施

3.1 转录组学在杂草抗性相关机理研究中的应用

明确杂草抗性产生的机理，筛选抗性相关基因和挖掘潜在新型靶标基因对于解决或减缓杂草抗药性的产生至关重要。

研究显示，非靶标抗性中诸多机制的发挥都伴随着相应基因的表达变化过程，因此转录组[36]分析技术已经应用到杂草非靶标抗性研究方面，例如Todd AG通过RNA-Seq技术研究禾草灵非靶标抗性硬直黑麦草（Lolium rigidum）喷施禾草灵后的转录差异图谱，筛选并初步鉴定了4个可能在硬直黑麦草非靶标抗性过程中具有重要功能的基因[37]。华南农业大学陈勇对抗百草枯牛筋草、中国农业大学郑明奇对抗苯磺隆的播娘蒿和南京农业大学董立尧对抗精恶唑禾草灵的罔草的转录组分析筛选到了与除草剂转运、吸收和降解等过程密切相关的差异表达基因[38]。而以转录组为研究对象的RNA-Seq技术无疑为更好地完善杂草非靶标抗性的产生机制提供了技术支持[23，37]。

3.2 传统化学控草技术的多样化

虽然化学除草剂的持续使用对杂草抗药性的产生具有一定的促进作用，但是杂草抗药性的产生是一个复杂的适应过程，化学除草剂仍然是最高效的除草方式。因此，除草剂的合理使用（多种除草剂交替使用、混用和阈值水平上使用除草剂等），不仅可以较大程度避免、延缓和控制杂草产生抗药性，并且还可以扩大杀草谱、减少除草剂用量和降低成本等[39-44]。

3.3 农艺及生物除草技术的应用

虽然杂草抗性发生越发严重，但可以通过采取一系列措施来减缓杂草抗药性的发生程度。例如，合理的农业生产操作（轮作、深翻、及时清除剩余杂草等），创造不适宜杂草生长的环境，抑制杂草萌发[45-48]；种植化感作物和研发高效微生物除草制剂等新型除草剂将成为大力发展和应用的技术[49-51]。

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