酶催化聚合及酶固定化技术的研究进展

刘 勇，苏铭吉，纪 萍，程珍琪，何培新

（有机化工新材料湖北省协同创新中心，有机功能分子合成与应用教育部重点实验室，湖北大学化学化工学院，湖北 武汉 430062）

酶催化聚合及酶固定化技术的研究进展

刘 勇，苏铭吉，纪 萍，程珍琪，何培新

（有机化工新材料湖北省协同创新中心，有机功能分子合成与应用教育部重点实验室，湖北大学化学化工学院，湖北 武汉 430062）

综述了酶体外催化聚合的反应机理, 归纳了参与催化高分子聚合反应酶的种类以及目前关于酶的固定化技术的研究进展，并对固定化酶催化聚合的研究进行了展望。

聚合；酶；固定化技术；研究进展；展望

随着科学的发展，高分子化合物在整个社会中占据着不可替代的经济地位。然而，常见的高分子合成反应都要用精密的设备控制好温度和压力，这对控制工业化生产成本来说是个巨大的难题。于是，各种各样的催化剂被用于高分子反应，增加反应体系的活性，以提高工业生产产率，降低成本。

合成高分子化合物的催化剂一般有酸、碱、自由基（第1类催化剂）和过渡金属及稀有金属（第2类催化剂）。而能体外催化聚合物合成的酶作为最新的第3类催化剂[1]。相较于前2类催化剂，允许体外催化聚合的酶包含明确定义的受控立体化学、区域选择性和化学选择性结构的各种天然和非天然聚合物。酶催化能给出比传统化学催化更精确的结构，反应在温和的条件下进行且不使用有毒试剂，通过化学可再生（生物质）起始底物，可减少重要化石资源的使用。本文总结了酶作为催化剂催化高分子聚合的机理、酶的种类以及酶的固定化技术，并对其未来发展前景进行了展望。

1 酶体外催化聚合的反应机理

目前，酶和底物之间的关系通常被认为是分子识别关系。对于体内反应，天然底物被酶特异性识别以形成酶-底物复合物[2，3]。复合物是由超分子之间的相互作用并激活底物所形成的，对反应产物具有优异的选择控制性。也就是说，复合物的形成对于发生反应是必要的，其中，基底必须被识别。对于酶催化的体外反应，人工基底也必须被识别，形成酶-人工底物复合物，然后活化人工底物以进行反应，生成可控选择性的产物。这种复合物对于反应是必不可少。因此，体外反应人工基底将被设计成可以被酶识别的单体。另外，L.Pauling[4]在1946年提出酶在温和的反应条件下引起催化聚合的具体原理是：酶和底物通过一个键和锁的化学交互形成复合物，激活基底以形成过渡状态，促使反应进行，其中活化能因为通过酶的稳定作用与没有酶作用的反应活化能相比而大大降低，使更多反应粒子能拥有不少于活化能的动能，从而加快反应速率。

催化聚合高分子反应的酶的种类主要有氧化还原酶，转移酶，水解酶3种[5]。

2 催化聚合酶的种类及应用

2.1 氧化还原酶

聚芳香族功能高分子在微电子技术、传感器、电磁干扰屏蔽和非线性光学材料等方面有巨大的潜在应用前景。近年来有关氧化还原酶催化合成芳香族功能聚合物的研究越来越多[6]，比如大豆过氧化物酶（SBP）和辣根过氧化物酶（HRP）等作为催化剂的投入使用。

Asuri P等[7]首次用辣根过氧化物酶在醋酸盐缓冲液和水溶性有机溶剂如1,4-二氧六环、丙酮或N，N -二甲基甲酰胺（DMF）的混合液中催化苯酚的聚合，该聚合按自由基反应进行，在H2O2氧化下，单体经酶催化生成酚氧自由基，再经过重排、偶联等反应形成聚合物。通过这种方式得到聚合物的过程要比用其他金属催化剂的催化反应环保且产率高。

M Shinkai等[8]用酶/化学法也合成了聚氢醌。他们分别以大豆过氧化物酶（SBP）和辣根过氧化物酶（HRP）催化剂、过氧化氢为氧化剂，在1,4-二六氧环和磷酸盐缓冲液中催化氧化4-羟基苯基苯甲酸酯，并在碱性条件下水解，脱去苯甲酸酯得到聚氢醌，得到的聚氢醌结构不同于用其他方法合成得到的产物。这说明酶催化的聚合物结构具有选择性。

2.2 转移酶

天然多糖存在于各种来源，如植物，动物，海藻和微生物界中，其具有特定的和非常复杂的结构，这不仅是由于单糖残基的结构多样性，还与糖苷键的立体和区域构型差异相关[9]。结构多样性的多糖作为宿主生物体中的一系列重要体内功能材料，能提供能量，充当结构材料，赋予材料特定的生物学性质，其中化学结构的微妙变化对多糖的性质和功能具有很大影响。由于多糖在医学，制药，化妆品和食品工业相关领域中的潜在应用前景，人工多糖的制备越来越受关注。而酶作为新型高效绿色催化剂在体外合成这种天然多糖高分子中也起到积极作用。

Kadokawa J等[10]用磷酸化转移酶催化α-D-葡萄糖-1-磷酸聚合，在各种疏水性聚合物如聚醚、聚酯、聚（酯-醚）和聚碳酸酯客体聚合物的存在下，以藤蔓的形式在客体分子上合成聚合物淀粉，组装成直链淀粉——聚合物包合络合物的多糖超分子。也体现了体外酶对合成非天然聚合物结构的良好选择性。

2.3 水解酶

在聚酯和聚酰胺等的合成中，脂肪酶是常用的水解酶类催化剂[11]。聚酯材料具有优异的力学性能，其中脂肪族聚酯及其共聚物具有良好的生物相容性和可降解性，这些特点使得聚酯材料成为高分子材料的重要组成部分。聚酰胺是用于汽车、电气和电子以及消费品行业中最大的工程聚合物家族之一；因此聚酰胺的酶促合成过程将对环境问题产生巨大的影响[12]。

Stavila E等[13]以南极假丝酵母脂肪酶B（CAL-B）为催化剂，通过三阶段方法，通过2,5-二羟甲基呋喃这种类似于芳族单体的生物基刚性二醇，合成了一系列具有约2 000 g/mol的数均分子质量（Mn）的新型生物基呋喃聚酯。

Schmidt S等[14]报道了以南极假丝酵母脂肪酶A（CAL-A），直接通过一锅两步酶法，产生的ε-CL进行原位开环合成寡聚-ε-CL。这种方法解决了ε-CL在更高浓度下酶抑制和失活的问题。形成的寡聚-ε-CL是疏水的，方便提取或沉淀分离。尽管聚合物的酶促合成，特别是酶开环聚合方法，已被充分运用，但聚酯的形成需要大量的有机溶剂，且在有水的情况下聚酯会发生水解，大大限制了聚酯的运用。但是，脂肪酶CAL-A具有独特的酰基转移酶，尽管存在大量的水，仍能使其有效形成聚酯产物。

3 酶的固定化技术

酶作为工业生产过程中的催化剂时，在温和的环境下仍具有高活性，高选择性和高特异性[15]。然而，游离酶在水溶液中稳定性差、易流失、不可回收，导致处理成本过高，限制了其应用。因此对游离酶用固定化技术将其固定化，使酶在保持其高效、专一及反应条件温和等酶催化反应特性的同时，还具有易操作、高贮存稳定性，以及可多次重复使用等优点，使得酶的使用效率提高，解决酶成本过高的问题，从而使酶催化聚合方法有更广阔的发展前景。固定化酶的性能主要取决于固定化方法和所使用的酶固定化载体[16]。常用的酶固定方法主要有物理方法和化学方法。

3.1 化学固定化技术

化学方法中，常通过醚，硫醚，酰胺或氨基甲酸酯键形成共价键。共价键是酶不可逆固定化方法中使用最为广泛的方法之一[17]。参与酶结合的官能团通常包括通过赖氨酸（ε-氨基），半胱氨酸（硫醇基）和天冬氨酸和谷氨酸的侧链，而对于酶和支持物之间的共价连接，酶结合的方向是决定其稳定性的关键因素。

Damnjanovíc[18]报道了共价结合的念珠菌脂肪酶是用于流化床反应器中产生芳香酯的强大且多功能的生物催化剂，共价固定的脂肪酶可以催化优化的丁酸二牛儿酯的合成，且酶因被固定化而使其使用率大大提高，成本也因此大幅度降低。

Dandavate V等[19]报道了当活性中心氨基酸不参与支持物的结合时，酶活性达到最高水平。与支持物的偶联可以2种方式进行，且偶联速度取决于待固定的分子中存在的活性基团的活性大小。这两种偶联方式分别为将反应性官能团加入到载体中而不进行改性，和将载体基质改性以产生活化基团。在这2种情况下，预期在载体上产生的亲电子基团将与蛋白质上的强亲核试剂反应。这种相互作用选择的矩阵通常包括琼脂糖，纤维素，聚氯乙烯，离子交换树脂和多孔玻璃。

3.2 物理固定化技术

物理方法的特征在于较弱的分子间相互作用，例如氢键、疏水相互作用、范德华力、亲和力结合，酶与载体材料的离子结合，或酶在载体内的机械容纳。Flickinger MC等[20]提出物理吸附方法可以被定义为可逆固定的直接方法之一，其涉及的酶被物理吸附或附着到载体材料上。其中吸附可通过弱的非特异性力如范德华力，疏水相互作用和氢键发生。

Brena BM等[21]在离子键合中，通过盐键结合酶。可以在温和的条件下从载体上除去可逆固定化的酶，如当酶活性已经衰变时，载体可被再生和重新装载新鲜的酶。通过这种方式在一定程度上解决了酶固定化造成的成本流失问题。

Chiou S H等[22]采用物理亲和方法成功开发了使用碳二亚胺偶联剂活化壳聚糖的羟基来将假丝酵母脂肪酶固定化，合成2种类型的壳聚糖珠。并使用化学分析电子光谱（ESCA）技术证实碳二亚胺活化壳聚糖羟基的能力。还研究比较了使用干和湿壳聚糖珠固定的脂肪酶性质。其中固定化增强了酶对pH和温度变化的稳定性，并在湿的固定化脂肪酶中观察到30 d的高贮存稳定性和高活性。

4 展望

酶作为新型催化剂应用于高分子聚合反应的研究目前还处于初期阶段，酶催化合成的生物医用、导电功能高分子材料已受到广泛关注。它们在生物医学、光电材料方面显示了极强的应用潜力。但是目前酶的资源有限、价格昂贵。所以利用固定化酶作为生物催化剂将引起来自工业的显著关注。固定化技术可在进一步研究酶催化聚合时节省成本，并从化学和分子生物学角度出发以现代技术联合工具为手段，将使其得到更广阔的发展，从而帮助改善酶固定策略和扩大催化库。

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Development of catalytic polymerization and lmmobilization technology of enzymes

LIU Yong, SU Ming-ji, JI Ping, CHEN Zhen-qi, HE Pei-xin
(Hubei Collaborative Innovation Center for Advanced Organic Chemical Materials, Key Laboratory for the Synthesis and Application of Organic Functional Molecules of Ministry of Education, College of Chemistry and Chemical Engineering, Hubei University, Wuhan, Hubei 430062, China)

In this paper, the mechanism of enzyme catalyzed polymerization in vitro, the related enzymes that can participate in the catalysis of polymer polymerization and the current research progress on the immobilization technology of enzymes were reviewed. Finally, the research on immobilized enzyme catalyzed polymerization was prospected.

polymerization; enzyme; immobilization technology; research progress; prospect

O643.36

A

1001-5922（2017）12-0062-04

2017-05-18

刘勇（1993-），男，硕士研究生，主要从事高分子材料的合成与性能研究。E-mail：1320398202@qq.com。通讯联系人：何培新（1957-），男，教授，博士研究生导师。主要从事功能高分子的制备与性能研究。E-mail：qpxhe@hubu.edu.cn。