甘青报春化学成分的提取、分离及结构分析

段国建，张浩波，陈 晖，孙明霞，彭晓霞

（甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州，730000）

甘青报春化学成分的提取、分离及结构分析

段国建，张浩波，陈 晖，孙明霞，彭晓霞

（甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州，730000）

为了进一步挖掘传统中药的活性成分，对报春花科植物甘青报春（Primula tangutica）的化学成分进行了分离及结构分析。利用柱层层析、制备薄层层析等分离手段分离得到4种化合物，并利用核磁共振波谱，高分辨质谱等，同时结合相关文献数据及理化数据分析，初步对所得化合物的结构进行了鉴定，4种化合物分别为4-羟基苯甲酸、槲皮素、山奈酚和萜类化合物。

甘青报春；分离；结构鉴定

甘青报春（Primula tangutica）属于报春花科报春花属植物，主要产于西藏东部、青海、四川西北部、甘肃等省份，其生长环境大多位于海拔3 300～4 700 m的高山草原、山坡湿润草地、高山灌丛等地带。甘草报春为多年生草本，植株高约4 cm。其藏语又名相哲姆保，奥勒西，是藏药“相相哲吾”中的一种原植物，为藏医用传统药材。在甘孜藏族地区，藏民们也广泛使用，其味微苦、涩，性微寒，无毒，具有安神止痛，退烧，清热敛疮，敛痛等功效，常用于治疗神经痛、关节痛、高血压及烫伤、疮疖等疾病[1-2]。

对报春花科植物药理作用的研究结果表明，此类植物广泛具有抗炎、解痉，免疫调节功能，抗肿瘤作用等。例如报春花科植物过路黄干燥全草的提取物具有良好的抗炎、解痉作用[3]；点腺过路黄全草提取物对小鼠腹腔巨噬细胞具有吞噬功能，对脾淋巴细胞产生IL-2 的影响作用[4]；报春花科植物中皂苷类成分抗肿瘤作用的靶点和途径广泛，除可直接杀伤和抑制癌细胞外，在增强机体免疫功能、抑制癌细胞的转移、诱导癌细胞的再分化等多个方面具有良好的活性[5]。鉴于对甘青报春的研究相对较少，而该药的药理研究尚未见文献报道。本文选择具有清热消炎功能藏药甘青报春为研究对象，对其有效部位进行深入研究，通过运用现代分离 (柱色谱、HPLC、PTLC等)、分析技术 (1H NMR、13C NMR、HRMS等) 对甘青报春提取物中多种化学组分进行了分析。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1供试药材甘青报春于2014年9月购于甘肃省碌曲县。经甘肃中医药大学李成义教授鉴定为甘青报春。

1.1.2供试药剂石油醚 (60～90 ℃)、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮和甲醇等均为分析纯试剂。显色剂：5%磷钼酸-乙醇溶液及碘。

1.1.3试验仪器1H NMR由Bruker Avanced III超导核磁共振仪测定，DMSO-d6作溶剂；柱层析硅胶(200～300目)，薄层层析硅胶 (硅胶H，GF 254) 均为青岛海洋化工厂出品。薄层 (II C) 检测用ZF-1三用紫外灯 (254和365 nm)。XMTD-8222型电热恒温鼓风干燥箱 (上海精宏实验设备有限公司)；SB-3200DTD型超声波清洗机 (宁波新芝生物科技股份有限公司)；RE-52AA型旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂)；200～300 柱层层析硅胶精制型 (青岛海洋化工有限公司)；薄层色谱硅胶预制板 (烟台市化学工业研究所)。

1.2 试验方法

1.2.1样品处理及制备干燥的甘青报春全草 (1.5 kg) 粉碎后用85%乙醇室温浸泡3次，每次7 d，浸出液经减压蒸除溶剂得浸膏50 g。浸膏用二氯甲烷 (500 mL) 溶解两次，过滤并减压蒸馏除去溶剂得浸膏15 g，然后以硅胶(200～300目)拌样，挥干溶剂后以200 g硅胶湿法装柱，用洗脱剂 (石油醚∶乙酸乙酯=5∶1～2∶1，二氯甲烷∶甲醇=50∶1～20∶1～10∶1～5∶1～2∶1) 梯度洗脱，经薄层检测合并极性相近的馏分，得11 个极性段 (A-K)。选择合适的极性段化合物进行进一步纯化，得到4种化合物。

1.2.2测 试通过1H NMR、13C NMR等技术进行分析。

2 结果与分析

试验分离得到4种化合物，结构鉴定如下。

化合物1，编号：PF-1，无色针状结晶。

1H NMR (400 MHz，DMSO-d6) δ：12.40 (s，1H)，10.22 (s，1H)，7.79 (d，J = 8.7 Hz，1H)，6.82 (d，J = 8.6 Hz，1H)，13C NMR(100 MHz ，DMSO-d6) δ167.5， 161.8，131.6，121.1，115.4。

由1H NMR（图1）和13C NMR（图2）数据可知，在化学位移为7.79和6.82 ppm处有两组双重峰，且偶合常数相等，可以推测此化合物应该含有一个对位取代的苯环结构；另外，在化学位移为12.40和10.22 ppm处分别有一个单峰，可以推断此化合物应该含有羟基、醛基或羧基结构，因为两个单峰出现的较为低场（化学位移大于10），同时两个峰型不相同（化学位移为12.40的单峰，峰型较宽；化学位移为10.22的单峰，峰型较窄）；其他位置没有特征峰出现，同时结合其薄层色谱法（TLC）极性较大的特点，可以推断此化合物应为含苯环的羧酸化合物。以上数据与文献[6]报道一致，该化合物鉴定为4-羟基苯甲酸。

图1 化合物PF-1的1H NMR谱图

图2 化合物PF-1的13C NMR谱图

化合物2，编号：PG-5，淡黄色粉末。

1H NMR (400 MHz，DMSO-d6) δ：12.48 (s，1H)，10.77 (s，1H)，9.57 (s，1H)，9.33 (s，1H)，9.28 (s，1H)，7.67 (d，J=2.5 Hz，1H)，7.53 (dd，J=8.5，2.5 Hz，1H)，6.88 (d，J=8.5 Hz，1H)，6.40 (d，J=2.2 Hz，1H)，6.18 (d，J=2.2 Hz，1H)；13C NMR (100MHz，DMSO-d6) δ：175.8，163.8，160.7，156.2，147.7，146.8，145.0，135.7，121.9，119.9，115.6，115.0，103.4，98.1，93.3。

由1H NMR和13C NMR数据可以看出，在低场区有5个单吸收峰，其他均为苯环区吸收峰，可以大致推断出此化合物应属于含5个羟基的黄酮类化合物。通过文献查询可知，以上数据与文献[7]报道的槲皮素的核磁数值较为一致，故鉴定此化合物为槲皮素(quercetin)。

图3 化合物PG-5的13C NMR谱图

化合物3，编号：PG-2，淡黄色粉末。

1H NMR (400 MHz，DMSO-d6) δ：12.47 (s，1H)，10.77 (s，1H)，10.10 (s，1H)，9.38 (s，1H)，8.03 (d，J=8.5 Hz，2H)，6.91 (d，J=8.5 Hz，2H)，6.43 (d，J=2.2 Hz，1H)， 6.18 (d，J=2.2 Hz，1H)。13C NMR (100 MHz，DMSO-d6) δ：175.9，163.8，160.7，159.2，156.1，146.8，135.6，129.5，121.6，115.4，103.0，98.2，93.4。

由1H NMR和13C NMR数据可以看出，此化合物与化合物2的结构相似，但在低场区只有4个单吸收峰，说明分子中应含有4个酚羟基，又由于除了苯环区吸收峰外再无其他吸收峰，因此可以判断此化合物应该同样属于黄酮类化合物。通过文献查询可知，以上数据与文献[7]报道的山奈酚的核磁数值较为一致，故鉴定此化合物为山奈酚(kaempferol)。

图4 化合物PG-2的13C NMR谱图

化合物4，编号：PI-3，白色粉末。

IR(KBr，cm-1)：3427，2956，2932，2870，1632，1460，1381，1076，1053，1028；1H NMR (400 MHz，DMSO-d6) δ：9.38 (s，1H)，4.78 (s，1H)，4.46 (s，1H)，4.12 (d，J = 6.0 Hz，1H)，3.87 (d，J = 8.2 Hz，1H)，3.69–3.56 (m，2H)，3.24 (d，J = 8.3 Hz，1H)，3.00 (dd，J = 11.4，4.3 Hz，1H)，2.73 (d，J = 16.0 Hz，1H)，2.15 (d，J = 12.4 Hz，1H)，2.00 (td，J = 13.4，12.9，6.1 Hz，2H)，1.86 (d，J = 13.3 Hz，1H)，1.70 (d，J = 16.0 Hz，4H)，1.55 (t，J = 12.4 Hz，4H)，1.40 (dd，J = 33.8，15.4 Hz，7H)，1.24 (s，7H)，1.16 (s，3H)，0.99 (s，3H)，0.96 (s，3H)，0.92 (s，3H)，0.86 (d，J = 6.4 Hz，1H)，0.82 (s，3H)，0.75 (s，3H)，0.69 (d，J = 9.8 Hz，1H)，13C NMR (100 MHz，DMSO) δ：212.60，207.16，106.27，88.09，85.78，74.40，73.17，71.48，68.08，65.52，55.60，55.11，54.92，49.84，49.64，47.66，45.42，42.75，40.03，38.91，36.58，33.50，31.35，29.47，27.94，26.29，25.58，24.10，21.87，18.81，18.50，17.52，16.64，16.21.

结合1H NMR（图5），13C NMR（图6）和DEPT（图7）核磁数据发现，该化合物中除了δH =9.38 (s，1H)处有一个单峰外，氢谱的低场区再无其他吸收峰，尤其是在化学位移为7附近没有任何吸收峰，同时，碳谱中在130 ppm附近也没有任何的吸收峰出现，说明此化合物中没有苯环结构存在。同时结合氢谱中9.38 ppm处的吸收峰和碳谱中210 ppm处的两个吸收峰，并且碳谱中210 ppm处的两个吸收峰在DEPT谱中消失，可以推断此化合物结构中应该含有一个醛基。由于在碳谱中210 ppm处出现了两个吸收峰，而氢谱的低场区只有一个单峰，可以推断此化合物结构中应该含有一个酮羰基或者丙二烯的结构，结合碳谱中106 ppm和88 ppm附近的吸收峰可以推断，此组信号峰更符合丙二烯的结构信息。在氢谱的4.78和4.46处的若的宽单吸收峰与末端双键质子的吸收信号非常吻合，但在碳谱中没有发现末端烯碳[δ 150 ppm]信号峰。结合氢谱中4.5～0.8 ppm区域内的多组吸收峰和碳谱中74～15 ppm范围内的多个吸收信号说明此化合物的骨架应该属于含有一个醛基和丙二烯结构的萜类化合物。推荐结构为4-(buta-2，3-dien-1-yloxy)-10-hydroxy-1，2，6a，6b，9，9，12 a-heptamethyldocosahydropicene-4a-carbaldehyde。此化合物结构仍需进一步验证。

图5 化合物PI-3的1H NMR谱图

图6 化合物PI-3的13C NMR谱图

图7 化合物PI-3的DEPT NMR谱图

3 讨论与结论

报春花科植物中主要化学成分有黄酮类、萜类、甾醇类、有机酸类、醌类等。这些成分在其他药物的研究中已有相关报道。王宇杰[8]和杨念云[9]分别从金钱草中分离到山萘酚及其系列衍生物、槲皮素、黄芪苷、金丝桃苷、vicenin22等黄酮类化合物。田景奎等[10-11]从黄连花和细梗香草中分别分离出cyclaminorin，pleglucocyclamin和 primulanin；candidoside、细梗香草皂苷I、细梗香草皂苷J等萜类化合物。甘青报春的化学成分的研究还未见相关报道。

试验对甘青报春提取物中多种化学组分进行分析，分离出4种物质，经鉴定分别为4-羟基苯甲酸、槲皮素、山奈酚和萜类化合物，这为甘青报春有效成分的研究提供了参考，为甘青报春的后续研究奠定了基础，有利于开发藏药，利用其天然产物进行新药研制和临床应用。

[1] 帝玛尔·丹增彭措.晶珠本草[M].上海：上海科学出版社，1980：320.

[2] 杨永昌.藏药志[M].青海: 青海人民出版社，1991：377.

[3] 张雅媛，马世平. 金钱草抗炎利胆有效部位研究及机理探讨[D].南京: 中国药科大学，2004：1-51.

[4] 韩星海，陈海生，孟济明，等. 点腺过路黄正丁醇部分提取物对小鼠免疫反应的影响[J]. 中药材，2002，25（12）：888-890.

[5] 王祎茜，唐丽华，梁中琴，等. 珍珠菜提取物 ZE4 对宫颈癌抑制作用的初步研究[J]. 中国药理学通报，2007，23（7）：925-929.

[6] 邹海艳，屠鹏飞.珍珠菜化学成分的研究[J]. 中草药，2009，40（5）：704.

[7] 彭 腾，涂永勤，邓 赘，等. 钟花报春花的化学成分研究[J].中药材，2008，31（1）：44.

[8] 王宇杰，孙启时.金钱草的化学成分研究[J].中国药物化学杂志，2005，15（16）：357.

[9] 杨念云，段金廒，李 萍，等. 金钱草中黄酮类化合物的分离与结构鉴定[J]. 中国药学杂志，2006，41（21）：1621-1624.

[10] 田景奎，邹忠梅，徐丽珍，等. 黄连花化学成分研究(Ⅲ)[J]. 中国药学杂志，2003，38（11）：836.

[11] 田景奎，邹忠梅，徐丽珍，等. 细梗香草化学成分的研究[J]. 中国药学杂志，2006， 41（3）：171-173.

（责任编辑：肖 亮）

Extraction, Separation and Structure Analysis on Chemical Compounds of Primula tangutica

DUAN Guo-Jian，ZHANG Hao-Bo1，CHEN Hui，SUN Min-Xia，PENG Xiao-xia
（College of Pharmacy, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, PRC）

The study of extraction, separation and structure analysis on chemical compounds of Primula tangutica has been conducted to develop traditional medicine of China in the future. Using the techniques of separation contain column chromatography (CC), preparative thin layer chromatography (PTLC) and recrystallization, through the results of H-Nuclear Magnetic Resonance (1H-NMR), C-Nuclear Magnetic Resonance (13C-NMR), High Resolution Mass Spectrum (HRMS), and combined with literature data, physicochemical data, we provided the reasonable structures of the separated compounds. Four kinds of chemical compounds were identifed as 4-hydroxy benzoic acid, quercetin, rhizoma kaempferiae phenol and terpenoids respectively.

Primula tangutica; separation; structure analysis

book=58,ebook=66

S512.1

A

1006-060X（2016）12-0058-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.012.019

2016-09-28

甘肃省高等学校科研项目（2013A-084）；甘肃中医药大学引进人才基金项目（BH2012-089）

段国建(1980－)，男，河北省冀州市，副教授，主要从事天然药物分子的分离分析及全合成研究。

张浩波