不同宫颈病变组织中人乳头瘤病毒16型E5基因的研究*

杨嘉洁 曹子洵 梁开如 左酌驰 左凤琼

(1.成都树德中学，四川 成都 610031；2.四川省妇幼保健院，四川 成都 610031；3.四川大学华西基础医学与法医学院，四川 成都 610041)

不同宫颈病变组织中人乳头瘤病毒16型E5基因的研究*

杨嘉洁1曹子洵1梁开如2左酌驰1左凤琼3△

(1.成都树德中学，四川 成都 610031；2.四川省妇幼保健院，四川 成都 610031；3.四川大学华西基础医学与法医学院，四川 成都 610041)

目的：探讨人乳头瘤病毒(Human papillomavirus type，HPV)16型E5早期基因在临床宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(Cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型及宫颈癌患者中的存在情况，判断HPV16 E5是否能作为临床宫颈癌的早期诊断治疗靶点，以利进一步研究HPV16的致癌机制。方法：从临床标本中筛选出HPV16阳性标本61例，根据病理诊断分为5组(宫颈炎组、CINⅠ级、CINⅡ级、CINⅢ级及宫颈癌组)，再应用PCR的方法分别测定各组组织中HPV16 E5 DNA的表达情况。结果：宫颈炎组E5 DNA阳性率为58.33%，CINⅠ级为63.64%，CINⅡ级为70.00%，CINⅢ级为44.44%，宫颈癌为77.78%，各组间阳性率差异无统计学意义。结论：E5 DNA不仅仅在宫颈癌早期存在，因而E5不能作为临床宫颈癌的早期诊断靶点，但可作为宫颈癌疫苗研究的靶点。

宫颈癌；人乳头瘤病毒(Human papillomavirus type，HPV)16；E5基因

宫颈癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，在全球妇女恶性肿瘤中，其发病率仅次于乳腺癌居第二位[1]。世界范围内，每年新发宫颈癌病例约50万，我国每年新发宫颈癌的病例约7.5万[2]，且发病呈现年轻化趋势[3]。流行病学及分子生物学资料证实，人乳头瘤病毒(Human papillomavirus type，HPV)感染为宫颈癌发生的必要条件[4-6]，特别是高危型HPV，是宫颈癌重要的致病因子[7]。有资料显示，宫颈癌病人HPV的阳性率为99.7%，其中约有一半的感染亚型为HPV16型[8]。在正常子宫颈由轻(CINⅠ)、中(CINⅡ)、重型(CINⅢ)子宫颈不典型增生到宫颈癌的进程中，HPV的感染促进了这个过程。HPV16刺激宫颈上皮细胞转化成肿瘤细胞与其3种早期癌蛋白E5、E6、E7的表达密切相关。国内外关于HPV16 E6、E7的研究较多，而E5的研究资料一直较少。以往的研究认为，肿瘤形成早期的阶段，E5的转录体及蛋白非常丰富，晚期肿瘤中的E5常因HPV16病毒整合至宿主细胞而缺失，但近年有研究认为并非所有晚期肿瘤病例均呈现HPV16单纯整合，还包括游离型与混合型[5,6]，因此E5在晚期肿瘤细胞中可能同样表达。

本研究通过收集不同病变程度临床标本，系统研究在宫颈炎症、典型性增生(Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级)以及宫颈癌患者宫颈组织中HPV16 E5基因情况。通过分析，我们可获知临床HPV16感染宫颈病变中E5DNA的第一手资料，从而获知HPVE5是否可作为临床宫颈癌早期诊断的靶点，为临床宫颈癌的早期诊断和进一步研究其致癌机制打下坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 临床标本

所有标本均采自于四川省妇幼保健院宫颈门诊。选取HPV16阳性的相应组织样本61份进一步进行E5基因的研究。根据临床病理诊断分别分为：宫颈炎组、CINⅠ级、CINⅡ级、CINⅢ级与宫颈癌组。

1.2 主要试剂

DNA提取试剂盒购自潮州凯普生物化学有限公司；Premix-Tag购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA相对分子质量标志物DL2000购自北京天为时代科技有限公司。其它试剂为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 组织标本中DNA的提取

采用凯普公司DNA提取试剂盒提取组织中病毒基因组DNA，操作按试剂盒说明书进行。

1.3.2 HPV16 E5 DNA的测定

1.3.2.1 HPV16E5引物的设计

根据GenBank中查得的东亚型HPV16全基因序列(基因登陆号：AF534061)设计扩增HPV16E5基因的上下游引物。上游引物：5′-GACAAATCTTGATACTGCATCCACA-3′，下游引物：5′-GACACAGACAAAAGCAGCGGAC-3′。扩增的片段大小为108 bp，为E5部分基因。内参为β-actin，上游引物：5′-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，下游引物：5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′，片段大小为132 bp。

1.3.2.2 HPV16 E5 DNA的测定

HPV16 E5 DNA的测定分为以下几个步骤：①PCR：扩增反应体系总体积为20 μl，包括 premix Tag10 μl，primer 0.5 μl，ddH2O 7.5 μl，组织DNA 2 μl。设置阴性对照。扩增条件为预变性95℃ 9 min，变性95℃ 30 sec，退火58℃ 30 sec，延伸72℃ 15 sec，共40个循环，后延伸72℃ 10min。②凝胶电泳：凝胶浓度为2.5%-3%，marker为DL2000，目标条带为108kb，电泳时电压为90 v，电泳时间为30 min。③结果判断：阴性对照无条带。样本处若相应位置(108 bp)出现目标条带，则为阳性结果，否则为阴性。

1.4 统计方法

利用EXCLE2010处理数据并建立数据库，SPSS16.0进行统计分析，采用Χ2检验，检验水准α设为0.05。

2 结果

2.1 组织样本中E5基因PCR扩增

以组织中提取的DNA为模板，以E5的特异引物进行进行PCR反应，PCR琼脂糖电泳结果见图1(部分结果)。可见，阴性结果无条带，阳性结果250 bp与100 bp之间有一明显条带，大小与预期值相符(108 bp)。内参β-actin PCR结果见图2，片段大小约为132 bp，与预期值相符。本实验中每一个样品β-actin PCR实验结果均为阳性，说明我们基因组DNA提取是完全成功的。

图1 PCR产物E5基因的琼脂糖电泳注：6，11：DNA marker(DL2000)；10：阴性对照；1，5：PCR阴性结果；2-4，7-9：PCR阳性结果(108 bp)

图2 β-actin的琼脂糖电泳注：1-11：β-actin；12：DNA marker(DL2000)

2.2 不同宫颈病变组织中HPV16E5基因阳性率分析

在不同组别HPV16阳性的标本中检测到E5基因的情况可见：宫颈炎中E5基因阳性率为58.33%，宫颈癌组中E5基因阳性率为77.78%，宫颈癌组中阳性率最高，见表1。但经SPSS检验分析，各组间P>0.05，差异无统计学意义。HPV16 E5基因并不仅仅在宫颈癌早期表达。

表1 HPV16 E5DNA在不同病变宫颈组织标本中的阳性率

3 讨论

人乳头瘤病毒(HPV)有多种基因型，到目前已经发现了150多种，与人生殖道感染有关的有40多种，其中20种与宫颈癌的发生相关[9]。根据致癌危险性可将HPV分为低危型和高危型。低危型HPV主要引起生殖道湿疣及轻度的宫颈上皮内瘤变(CINⅠ)，高危型HPV主要引起中、重度的宫颈上皮内瘤变(CINⅡ、CINⅢ)和宫颈癌。

HPV16是高危型病毒，其E5基因编码83个氨基酸的小蛋白。E5蛋白主要存在于细胞膜[10]、高尔基体、内质网膜及核膜中，有研究提示它主要在感染细胞的早期繁殖、扩张中起重要作用[11]，但近年有研究认为E5在晚期肿瘤细胞中因HPV16基因并非单纯整合(还包括游离型与混合型)因此可能同样存在[5-6]。

Chang等[12]以免疫组化的方法，研究HPV16感染的不同宫颈病变组织发现，在低级的CIN和高级CIN病变组织中均有HPV16E5蛋白的表达，在侵入性宫颈癌中发现40%的样本中E5蛋白表达。

本研究中，宫颈炎组E5 DNA阳性率为58.33%，CINⅠ级为63.64%，CINⅡ为70.00%，CINⅢ级为44.44%，宫颈癌为77.78%，各组间阳性率差异无统计学意义，HPV16 E5基因并不仅仅在宫颈癌早期表达。该研究与我们推测的E5基因可能仅存在于宫颈病变的早期相反，但与Chang等研究结果相同，这也与胡家昌[10]等认为的晚期肿瘤病例中包括游离型与混合型HPV16，E5在晚期肿瘤细胞中可能同样存在的观点相吻合。E5基因在宫颈病变不同程度中均存在，且在宫颈癌晚期阳性率较高，提示我们可将HPV16E5作为宫颈癌疫苗研究的靶点之一。

1 Rob L, Halaska M, Robova H. Nerve-sparing and individually tailored surgery for cervical cancer[J]. Lancet Oncol, 2010, 11(3): 292-301.

2 吴斌,于晓红. HPV与宫颈腺癌研究进展[J]. 江西医药, 2015, 50(2): 180-182.

3 Zhang MJ, Katanoda K. Comparison of time trends in uterus cancer and cervix uteri cancer mortality (1990-2006) in the world, from the WHOmortality database[J]. Jpn J Clin Oncol, 2010, 40(1): 98-99.

4 Tommasino M. The human papillomavirus family and its role in carcinogenesis[J]. Semin Cancer Biol, 2014, 26(6): 13-21.

5 朱义保,谢彤,杨亮亮,等. 人乳头瘤病毒HPV16整合与宫颈病变程度的研究[J]. 实验与检验医学, 2015, 33(4): 395-398.

6 胡家昌,李芳. 高危型HPV DNA与宿主基因整合及致癌机理的相关研究进展[J].现代妇产科进展, 2015, 24(5): 384-386.

7 Bernard HU, Burk RD, Chen Z, et al. Classification of papillomaviruses (PVs) based on 189 PV types and proposal of taxonomic amendments[J]. Virology, 2010, 401(1): 70-79.

8 聂妹芳,李登清,黄民主,等. 11461例妇科门诊患者HPV亚型感染状况的研究[J].中国现代医学杂志, 2011, 21(27): 3434-3438.

9 Jung WW, Chun T, Sul D, et al. Strategies against human papillomavirus infection and cervical cancer[J]. J Microbiol, 2004, 42(4): 255-266.

10Hu L, Ceresa BP. Characterization of the plasma membrane localization and orientation of HPV16 E5for cell-cell fusion[J]. Virology, 2009, 393(1): 135-143.

11Fehrmann F, Klumpp DJ, Laimins LA. Human papillomavirus type 31 E5 protein supports cell cycle progression and activates late viral functions upon epithelial differentiation[J]. J Virol, 2003, 77(5): 2819-2831.

12Chang JL, Tsao YP, Liu DW, et al. The expression of HPV-16 E5 protein in squamous neoplastic changes in the uterine cervix[J]. J Biomed Sci, 2001, 8(2): 206-213.

Study on human papillomavirus type 16 E5 gene in different cervical lesions*

Yang Jia-jie1, Cao Zi-xun1,Liang Kai-ru2,ZuoZhuo-chi1, Zuo Feng-qiong2△

(1.Chengdu Shude High School, Sichuan Chengdu 610031;2.Sichuan Maternal and Child Health Hospital, Sichuan Chengdu 6100313;3.West China of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041)

Objective：To investigate E5 gene of human papilloma virus (HPV)16 in clinical cervicitis, CIN I, CIN II, CIN III and cervical cancer patients;to determine whether HPV16 E5 can be used as early diagnosis target for clinical cervical cancer; to further study the mechanism of carcinogenesis of HPV16. Methods: Sixty-one cases were selected from HPV16 positive specimens which were divided into 5 groups according to the pathological diagnosis (cervicitis group, CIN I, CIN II, CIN III and cervical cancer group). HPV16 E5 DNA was measured by PCR. Results: The positive rate of DNA E5 was 58.33% in cervicitis group, 63.64% in CIN I, 70% in CIN II, 44.44%in CIN III, and 77.78% in cervical cancer. Between groups the positive rate was not statistically significant. Conclusion: DNA E5 not only exists in the early stage of cervical cancer, so E5 cannot be used as a target for early diagnosis of cervical cancer, but it can be used as a target for cervical cancer vaccine research.

Cervical cancer; Human papillomavirus type 16; E5 gene

四川省科技厅基金(编号：2012JY0017)

杨嘉洁，女，成都树德中学高2015级学生，Email：397480785@qq.com。

△通讯作者：左凤琼，女，高级实验师，主要从事医学微生物学与免疫学教学及科研工作，Email：497465261@qq.com。

2016-11-1)