猪流行性腹泻病毒和大肠杆菌混合感染的诊断

李 超，王宇婷，倪宏波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

猪流行性腹泻病毒和大肠杆菌混合感染的诊断

李 超，王宇婷，倪宏波⋆

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

2016年4月，大庆某猪场发生一起以2～7日龄哺乳仔猪腹泻、脱水和高死亡率为特征的传染病，发病率为30%，死亡率达50%以上，给猪场造成了很大的经济损失。根据流行病学调查、临床症状观察、病畜剖检和实验室诊断，最终确诊为猪流行性腹泻与大肠杆菌混合感染。对分离细菌进行药敏试验，结果显示，盐酸头孢噻呋钠、硫酸头孢喹肟和多黏菌素B对大肠杆菌高度敏感，而庆大霉素和卡那霉素有一定耐药性。

猪流行性腹泻病毒；大肠杆菌；混合感染

在集约化养猪生产的条件下，仔猪腹泻是一种典型的多因素性疾病。近年来，因腹泻死亡的仔猪占仔猪死亡总数的38.9%[1]，给养殖场造成较大的经济损失。引起仔猪腹泻的病原很多，其中传染性病原是导致仔猪高发病率和高死亡率的重要原因，为了防止疾病的进一步蔓延，需要对病原进行快速、准确的诊断。许多研究证明，引起仔猪腹泻的重要病原有致病性大肠杆菌（Enteropathogenic Escherichia coli，EPEC）、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine virus，TGEV）、猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus of swine virus，PEDV）和猪轮状病毒（Rota virus of swine virus，RDV)[2]。

仔猪高死亡率是亚洲PED爆发的特点，而且临床上无法与急性TGEV相区别，仔猪患病后一般先腹泻后呕吐，迅速脱水，皮肤变红停止吃乳，精神不振，死亡率极高，成年母猪发病率15%～90%不等，表现为一过性腹泻并伴有产奶和食欲下降现象[3]。据报道我国有80%的猪场感染过PEDV，发病率约40%，哺乳仔猪死亡率达90%以上，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。

猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起猪的一种急性肠道传染性疾病。临床上主要表现为肠炎、肠毒血症等多种症状[4]。常见的有仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿病3种。这三种疾病可造成仔猪大量死亡或生长发育不良，成为养猪业发展的严重障碍之一[5]。猪肠道内大肠杆菌过量繁殖和肠道内菌群失调是本病的重要病因。江苏省农业科学院试验证实猪轮状病毒是仔猪白痢的病因之一。气候的变化和饲养管理不当是本病发生的最主要的诱因[6]。猪水肿病是由溶血性大肠杆菌毒素所引起的断奶仔猪眼睑或其他部位水肿、神经症状为主要特征的疾病。该病多发于仔猪断奶后1～2周，发病率约5%～30%，病死率达90%以上[7]。近几年，本病又有新的流行特点：首先，发病日龄不断增加，据各地反馈情况40～50 kg的猪也有水肿病的发生；其次，吃得越多、长得越好的猪，其发病率和死亡率越高。

本文根据对大庆市某猪场送检猪的病理剖检和实验室诊断，确诊其发病原因是该猪同时感染猪流行性腹泻病毒和大肠杆菌。

1 材料与方法

1.1 病料的采集 大庆地区某猪场送检的无菌采集的猪的肺脏、肝脏、脾脏、肾脏和肠，供实验室诊断用。

1.2 试剂 Marker DL 2000购自大连宝生物工程有限公司，TIANamp Genomic DNA Kit DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司，PCR Master Mix缓冲液，RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒购自MBI公司。其余试剂均为国产分析纯。

1.3 引物设计 根据GenBank中已发表的猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎和轮状病毒的基因序列设计特异引物。

1.4 细菌分离培养 无菌剪取一小块深部组织脏器，接种涂抹于5%兔血琼脂培养基上，分别做需氧和厌氧培养，置37℃恒温箱中24 h，同时用接菌环挑取肠内容物接种在伊红美蓝和麦康凯培养基上，置37℃恒温箱中需氧培养24 h，观察菌落形态和溶血情况等，挑取疑似菌的单个菌落进行纯培养。

表1 引物序列Table 1 Peimer sequence

1.5 核酸的提取及鉴定

1.5.1 组织DNA和RNA提取 按照TIANamp Genomic DNA Kit操作进行提取DNA；按照RNeasy Plus Mini Handbook RNA提 取 盒 进 行 提 取RNA，-20℃保存备用。

1.5.2 RNA反转录和PCR扩增 按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录盒说明书操作步骤将病毒提取的RNA进行反转录，得到的cDNA在-20℃进行保存备用。用得到的DNA和cDNA为模板，猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎和轮状病毒特异性引物进行PCR反应扩增，取10 μL的扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6 药敏试验 将鉴定为大肠杆菌的纯培养物用接种棒均匀涂布在鲜血培养基上，将药敏纸片（庆大霉素、卡那霉素、恩诺沙星等10种药物）分别贴于平皿中，37℃培养24 h，测定抑制菌圈直径大小，根据检测标准判定结果。

2 结果与分析

2.1 剖检变化 剖检可见剖检病死猪结肠内容物呈浆状、糊状或油膏状，呈乳白色或灰白色，部分粘附于黏膜上，不易完全剥离，肠黏膜有卡他性炎症变化，肠系膜淋巴结轻度肿胀，胃黏膜出血伴有凝块，肾盂有黄色物质，肠壁变薄透明状，小肠伴有鼓气等症状。

图1 胃黏膜出血伴有凝块Fig.1 Gastric mucosal bleeding with clot

图2 肾盂内有黄色物质Fig.2 Yellow substance in the renal pelvis

图3 小肠胀气，肠壁变薄呈半透明状Fig.3 Intestinal flatulence,intestinal wall became thin and translucent

图4 肠系膜充血，肠系膜淋巴结肿大Fig.4 Mesenteric lymph node,mesenteric lymph node

2.2 革兰氏染色 将病料中所分离的细菌进行纯培养，进行革兰氏染色、涂片、镜检。可见到革兰氏染色阴性杆菌，中等大小，直杆菌（见图5）。由于大肠杆菌和沙门氏菌的形态及染色特征十分相似，所以为了区分这两种细菌，又分别接种于伊红美蓝和麦康凯培养基进行鉴别培养，结果为麦康凯培养基长出粉色，光滑，圆形菌落；在伊红美蓝培养基长出紫黑色，金属光泽菌落（见图6、图7）。

图5 革兰氏染色两端钝圆杆状菌（10×10）Fig.5 Gram stain on both ends of blunt round bar(10×10)

图6 伊红美蓝培养基 菌落金属光泽Fig.6 Eosin methylene blue medium colony metallic luster

图7 麦康凯培养基 圆形菌落粉色、光滑Fig.7 Makanke culture medium round colony pink,smooth

2.3 PPCCRR结果 以组织中提取的病毒DNA以及病毒RNA反转录的cDNA为模板，分别选用猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪轮状病毒的特异性引物进行PCR鉴定。其中第1孔在507 bp左右有一条条带，与猪流行性腹泻病毒预期片段大小相符（如图8）。

图8 PCR电泳分析图Fig.8 PCR electrophoresis analysis chart

2.4 药敏试验结果

表2 药敏结果Table 2 The results of drug susceptibility

3 讨论

3.1 发病原因 对该猪场仔猪的发病原因进行调查，该猪场饲养管理水平低，饲养密度大，饲料不科学；环境消毒不合格，排泄物没有无害化处理；免疫程序混乱，没有经过科学的疫苗免疫程序。这些因素给病原提供大量繁殖并发生变异的机会，造成多种病原存在猪只体内，当环境骤变时，猪体抵抗力下降，病原侵入猪体造成严重损失。

3.2 防治措施 环境净化。猪场环境要经常消毒，疫情严重威胁时，每天消毒1次，连续消毒1周，以后夏天每周2次，冬天每周1次；猪舍净化。在多数猪场尚无多点生产体系情况下，保育舍和育肥舍要作到单元式全进全出生产管理，即每个猪舍的用具、人员等要独立，用具不可共用，人员不要来往[8]。保育猪转舍，育肥猪出栏后，要最少空舍2周，这2周内至少要消毒2次；体外净化。转入新猪舍的第1周每天带猪消毒1次，以后每周消毒1～2次；体内净化。母猪产前产后7 d、子猪断奶前后1周、转群前后1周饲料中加中元败毒威和黄芪多糖。用流行性腹泻和大肠杆菌疫苗免疫接种，间隔半月再补防1次。要加强护理，一旦发现病猪最好隔离，单独饲养，给它创造一个安静舒适的环境，减少应激，有利于疾病的康复。

4 结论

通过对该病死猪的病理解剖和实验室诊断，确诊送检的病死猪死亡原因是该猪感染了猪流行性腹泻病毒和大肠杆菌，但是主要病因是猪流行性腹泻病毒，因为免疫力下降时会出现致病性大肠杆菌增多，这种情况下才会有大肠杆菌感染，属于继发感染。

[1]于晓龙.猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒混合感染的调查[J].安徽农学通报，2007，13（14）：156-157.

[2]乔瑾，赵保生.规模化猪场生物安全控制技术研究[J].畜牧兽医杂志，2011，（4）：102-105.

[3]Kadoi K,Sugioka H,Satoh T,et al.The propagation of a porcine epidemic diarrhea virus in swine cell lines[J].The new microbiologica,2002,25(3)∶285.

[4]钱峰.仔猪出血性大肠杆菌病的诊断与防治[J].上海畜牧兽医通讯，2009（4）：101.

[5]李永明.猪大肠杆菌病病原学研究概况[J].贵州农业科学，1990（4）：39-41.

[6]李志贵.浅谈仔猪自痢的综合防治措施[J].中国畜牧兽医义摘，2012，28（7）：44-65.

[7]魏杰，韩方伟，林建平，等.仔猪黄自痢的预防和治疗[J].畜牧与兽医，2011（3）：122.

[8]万遂如.规模化猪场防控猪疫病的综合技术措施[J].现代畜牧兽医，2014（2）：33-40.

Porcine Epidemic Diarrhea Virus and E.coli Infection in Laboratory Diagnosis and Susceptibility Testing

Li Chao，Wang Yuting,Ni Hongbo*
(College of animal science and technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Heilongjiang Daqing 163319)

April 2016,a pig farm in DaQing occurred 2 to 7-day-old piglets diarrhea,dehydration and high mortality characteristics of infectious diseases,the incidence rate was 30%and the mortality rate of more than 50%,make farms caused great economic losses.According to epidemiological investigation,clinical observation,autopsy and laboratory diagnosis of sick animals, and ultimately diagnosed as porcine epidemic diarrhea and E.coli infection.Isolated bacteria susceptibility test results showed that sodium hydrochloride ceftiofur,cefquinome sulfate and polymyxin B against E.coli highly sensitive to gentamicin and kanamycin have some resistance.

Porcine epidemic diarrhea virus;Escherichia coli;The mixed infection

S858.28

B

1672-9692(2016)12-0044-04

2016-11-01

李超（1993-），男，黑龙江人，在读硕士，研究方向为分子细菌学和免疫学。

倪宏波（1972-），男，黑龙江人，教授，博士生导师，主要从事分子细菌学和免疫学研究。