CDV、CAV疫苗三免后鸭蛋卵黄抗体制备及效价消长规律探究

张岩彬

（辽宁省畜产品安全监察所，辽宁 沈阳 110003）

Zhang Yanbin

(The Liaoning Institute of safety supervision for animal products,Liaoning Shenyang 110003)

CDV、CAV疫苗三免后鸭蛋卵黄抗体制备及效价消长规律探究

张岩彬

（辽宁省畜产品安全监察所，辽宁 沈阳 110003）

利用犬瘟热商品疫苗和狐狸脑炎商品疫苗分别免疫开产蛋鸭，三免后收集高免鸭蛋，用水稀释法和硫酸铵两步沉淀法提纯卵黄抗体。采用SDS-PAGE检测鸭源IgY浓度，中和试验和HA-HI试验测定相应效价。结果表明，水溶法制备的卵黄抗体浓度为6.33 mg/mL，得率为60%～70%。免疫CDV疫苗组和CAV疫苗组可以很快产生特异性抗体。在30～60 d内，卵黄抗体效价极高；在60～120 d内，卵黄抗体效价维持较高水平；在120～180 d内，效价趋近于零。

犬瘟热病毒；狐狸脑炎病毒；卵黄抗体；消长规律

Zhang Yanbin

(The Liaoning Institute of safety supervision for animal products,Liaoning Shenyang 110003)

犬瘟热和狐狸脑炎是危害毛皮动物养殖的两种主要急性、高度接触性传染病，其病原体分别为犬瘟热病毒（canine distempervirus，CDV）和犬腺病毒（canine adenovirus，CAV）。狐狸、貉、水貂等毛皮动物普遍易感，幼兽致死率极高。目前，这两种疫病在毛皮动物各主要养殖地域均有群发性流行记录[1-2]。

通过接种疫苗能够较有效地预防这两种疫病，但CDV和CAV的弱毒商品化疫苗存有热稳定性差、易受母源抗体干扰、毒力返祖返强、一过性免疫抑制等弊端。所以，近年来人们开始寻求新的免疫替代性方案。卵黄抗体（Immunoglobulin of yolk，IgY）作为一种廉价高效、制备简单的生物制品备受人们关注。卵黄抗体是一类在禽类动物体内广泛存在的特异性免疫球蛋白，通常伴随血液循环在卵巢中富集蓄积并最终进入卵黄。在临床上目前大规模生产卵黄抗体多采用水溶法（water dilution，W.D.）[3-4]。

在本研究中，通过CDV、CAV商品化疫苗免疫康贝尔蛋鸭，并对其开产6个月内产蛋进行了IgY提纯和效价检测，绘制出了IgY效价消长规律曲线。

1 材料和方法

1.1 试验材料 免疫抗原：采用北京生态康生物技术研究所生产的CDV（生产批号：1412077）、CAV（生产批号：141123）商品疫苗。

试验动物：空白免疫背景的120日龄康贝尔蛋鸭30只。

主要试剂仪器：DYCZ-28D型电泳仪（北京六一仪器厂）、ZF-258型凝胶成像仪（上海方畦仪器有限公司）、1%人O型红细胞、血凝板、Hyclone胎牛血清（500 mL）、96孔细胞培养板、光学倒置显微镜等。

1.2 试验方法 前期准备：将30只110日龄空白免疫背景的康贝尔蛋鸭在封闭环境中饲养至开产，每组10只，采用胸肌、翅下肌肉注射方式，分别对应接种CDV、CAV和生理盐水。1 mL/次，共计3次，间隔期1周。在三免后1周、2周、3周、4周、8周、12周、16周、20周和24周采集相应鸭蛋样本。

鸭源卵黄抗体制备提纯：将高免鸭蛋消毒、清洗、吹干，无菌室里手动剥离卵黄，去除蛋清，划破卵黄膜，用量筒准确测定体积。加入9倍去离子水，搅拌混匀6 h，用稀盐酸调节pH至5.3～5.4，4℃静置过夜，中速离心后分离获取上清。在上清中加入硫酸铵依次至50%和33%饱和度，中速离心后收集析出沉淀。用无菌PBS重悬溶解后至透析袋中除盐，萘氏试剂检测合格后，将滤液用0.22 μm滤膜过滤除菌，4℃储存备用。

鸭源IgY组成、含量、浓度及效价测定：分别用SDS-PAGE检测提取物IgY成分，ZF-258型凝胶成像仪分析蛋白含量，BCA蛋白浓度试剂盒测定IgY浓度。用细胞中和试验测定CDV组IgY抗体效价，用HA-HI试验测定CAV组IgY抗体效价。

卵黄抗体效价测定

血清中和试验：采用Reed-Muench法[1]测得CDV疫苗弱毒半数组织感染量（TCID50）为106/mL，采用固定病毒-稀释血清法做细胞中和试验。在96孔细胞培养板培养BHK-21细胞24 h至细胞长满80%时，将IgY做100倍稀释，等量吸取200TCID50CDV弱毒与IgY 37℃感作2 h，接种BHK-21细胞，培养观察感染效应。

HA/HI试验：CAV能与人O型红细胞发生凝集反应[1]，测出该CAV病毒血凝效价为1∶256。依据血凝效价配制4血凝单位的CAV病毒液，采用固定病毒稀释血清的方法，将IgY在血凝板上依次2倍倍比稀释，测定血凝抑制（HI）效价。

鸭源IgY无菌检验：将提取除菌后的IgY分别接种于葡萄糖蛋白胨培养基、硫乙醇酸盐培养基、酪陈培养基中，25℃和37℃下培养72 h，观察是否有细菌生长。

图1 12%SDS-PAGE检测提取鸭源IgYFig.1 12%SDS-PAGE detection of duck source IgY extraction

2 结果

2.1 SDS--PPAAGGEE检测提取纯化的鸭源IIggYY 见图1。

12%SDS-PAGE结果表明，提取鸭源卵黄抗体主要分布于67 kD和38 kD，图像经Quality One凝胶成像分析软件分析，IgY目的蛋白占泳道总蛋白的60%～70%。经BCA蛋白浓度检测试剂盒测得卵黄蛋白浓度为6.33 mg/mL。

图2 CDV中和试验BHK细胞出现的“合胞体”Fig.2 Syncytium in BHK Cells for CDV Neutralization test

图3 CAV组鸭源IgY HI效价测定Fig.3 CAV group of duck origin HI IgY titer determination

2.2 效价的测定 见图2和图3。

CAV的血凝效价为1∶256，为1个血凝单位。将CAV病毒液稀释至4个血凝单位，即1∶64。血凝抑制试验结果表明，提取的IgY能够有效中和CAV，血凝抑制效价在1∶256～1∶512之间。

2.3 效价变化规律 见图4和图5。

图4 CDV组IgY抗体中和效价Fig.4 IgY antibody neutralization titer ofCDV group

图5 CAV组IgY抗体血凝抑制效价Fig.5 CAV group IgY antibody titers of blood coagulation

透析后IgY溶液做100倍稀释后进行效价测定，上述两组效价测定结果表明，IgY效价消长趋势基本一致。在接种CDV 200TCID50条件下，中和效价峰值达到了1∶104；CAV组HA效价为1∶256，其IgY HI效价峰值达到了1∶350。

在持续时间上，两组均表现为16～20周内有较好的抗体水平。20周后抗体效价下降迅速，至24周时与阴性组差别不大。

成功运用水溶法提取了较高浓度鸭源的卵黄抗体，得率在60%～80%，同时绘制了三免后IgY浓度和效价的消长曲线。三免后抗体效价迅速上升，到峰值后下降，在20周内二者消长规律基本一致。至20～24周时，抗体效价与阴性组相差不大。

以上结果为临床上大规模提取纯化IgY奠定了理论基础，也为毛皮动物常见疾病（CDV、CAV）的预防和治疗提供了新的途径。

2.4 鸭源IIggYY无菌检验结果 25℃和37℃下培养72 h，在葡萄糖蛋白胨培养基未发现有细菌生长，表明IgY滤过液中无腐生菌、霉菌存在。在硫乙醇酸盐培养基、酪陈培养基中均未有细菌生长，表明IgY滤过液中无厌氧性和需氧性细菌的存在。

3 讨论与展望

3.1 禽蛋的选择 提取卵黄抗体以鸡蛋较为常见，对于鸭（鹅）蛋研究较少。目前，对于鸭、鹅等水禽聚居区，选用鸭（鹅）蛋作为IgY提取对象较为适宜。在本试验中，尝试并证明了鸭源卵黄抗体提取的可行性，绘制了三免后抗体消长规律等，为临床上大规模生产鸭源卵黄抗体提供了借鉴。

3.2 鸭源IIggYY的提纯 水溶法提取鸭源卵黄抗体，稀释倍数不宜过高或过低。经多次试验，在1∶10稀释时提取效率最高。溶液体积不会过大，卵黄也几乎没有沉淀；对于卵黄液中含有的大量蛋白质、脂肪等杂质，在提纯时必须尽可能多的除去。此时，加入少量氯仿或者正辛酸搅拌可有助于除脂；在4℃条件下静置3 h以上，有利于沉淀、脂质和上清的分层；硫酸铵两步沉淀法多采用50%和33%饱和度，在透析袋选择上要选截留量30 kD以上，以减少蛋白质、脂质等杂质留存和确保铵根离子完全除去；在滤膜过滤除菌时，可先选用0.45 μm滤膜再用0.22 μm滤膜过滤，以减少滤膜堵塞和浪费[5]。

3.3 鸭源IIggYY的浓度及效价检测 经过12% SDS-PAGE分析后，条带集中于67 kD和38 kD间，与先前文献报道相一致。经Quality One凝胶定量分析软件分析，IgY纯度最高为68.4%，BCA蛋白浓度检测试剂盒测得卵黄蛋白浓度为6.33 mg/mL。

效价测定上，CDV采用了更为精确、直接的细胞中和试验。CAV能特异性地与人O型红细胞发生凝集，采用了操作简单便捷的HA-HI试验。经检测，这两组效价峰值极高，在三免120～150 d内具有高保护作用。在150～180 d内，抗体保护趋于作用。这对于免疫节点的选择至关重要。

以上结果为临床上大规模提取纯化IgY奠定了理论基础，也为毛皮动物常见疾病的预防和治疗提供了新的途径[6-7]。作为毛皮动物的两种主要疫病，疫苗接种防治CDV和CAV的主要方式。但疫苗接种存有毒力返祖返强、一过性免疫抑制等诸多不安全因素。卵黄抗体技术相应地解决了这一问题并且已经发展相对成熟[7]，未来随着生物制品种类和市场的日益丰富，卵黄抗体产品也必将有着广阔的市场和光明的未来。

[1]殷震，刘景华.动物病毒学（第二版）[M].北京：科学出版社，1997，755-767.

[2]蔡宝样.家畜传染病学(第四版)[M].北京：中国农业出版社，2001，301-304.

[3]张小莺，陈琛.卵黄抗体技术[M].北京：科学出版社，2011，7-19.

[4]Rǜdiger Schade，张小莺，郑礼.IgY技术及其医药应用：理论基础[J].中国药理学通报，2004，5：491-495.

[5]刘志强.犬细小病毒（CPV）的分离鉴定及其卵黄抗体治疗制剂的研制[J].石河子大学报，2008（12）：33-35.

[6]闫新华，闫喜军，赵传芳，等.水貂肠炎病毒高免卵黄抗体的制备及应用[J].中国预防兽医学报，2000，22（4）：306-307.

[7]王小柱.MEV灭活疫苗免疫后鸡蛋卵黄抗体消长规律的探究[J].现代畜牧兽医，2016，6：14-17.

The study of IgY variation rules after immunization with CDV,CAV inactivated vaccine

The commercial Fox Encephalitis Vaccine and canine distemper vaccine were immunized with new laying ducks.After immuned 3 times,we collected the eggs to extract IgY with Water dilution method and ammonium sulfate two step precipitation method.SDS-PAGE was used to detect the IgY concentration of the eggs,and the corresponding titer was determined by neutralization test and HA-HI test.The results showed that the concentration of IgY prepared by the water solution method was 6.33 mg/mL,and the yield was 60%～70%.Immunization of the CDV vaccine group and the CAV vaccine group can produce specific antibodies very soon.Within 30-60 days,the IgY titer was very high.In 60～120 days,the yolk antibody titer remained high.Within 120～180 days,the titer was close to 0.

Canine distempervirus;Canine adenovirus;Immunoglobulin of yolk;Variation rules

S858.2

B

1672-9692(2016)12-0039-05

2016-11-06

张岩彬（1966-），男，本科，畜牧师，主要研究方向：动物饲养及疾病防控，畜产品安全监督。