UGT1A6 A541G基因多态性对癫痫儿童丙戊酸钠血药谷浓度的影响

姜永生，杨 琳

(西安交通大学第二附属医院儿科，陕西 西安 710004)



UGT1A6 A541G基因多态性对癫痫儿童丙戊酸钠血药谷浓度的影响

姜永生，杨 琳

(西安交通大学第二附属医院儿科，陕西 西安 710004)

目的 探讨尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(UGT)1A6 A541G基因多态性对丙戊酸钠血药谷浓度的影响。方法 患儿服药至少5个半衰期后，丙戊酸钠血药谷浓度达到稳态时采集静脉血，全血基因组DNA提取后经PCR扩增目标基因，使用焦磷酸测序技术检测UGT1A6 A541G基因多态性，同时气相色谱法测定丙戊酸钠血药谷浓度。结果 在67例患儿中，UGT1A6 A541G基因型为A/A者49例(73.1%)，A/G者17例(25.4%)，G/G者1例(1.5%)，根据基因型分为A组(A/A者)和B组(A/G者和G/G者)。B组患儿丙戊酸钠的标准血药谷浓度均值(3.43±0.38)mg/mL较A组(4.13±0.21)mg/mL低，结果有显著统计学差异(t=2.51，P<0.05)。结论 UGT1A6 A541G基因多态性影响丙戊酸钠的代谢与排泄，提示含有UGT1A6 A541G等位基因的患儿口服丙戊酸钠应高于常规用量。

UGT1A6 A541G基因多态性；丙戊酸钠；癫痫；儿童

丙戊酸钠是目前临床上最常用的一线抗癫痫药物之一，临床发现丙戊酸钠的用药剂量和血药谷浓度存在很大的个体差异，部分患儿即使应用较小剂量，其血药谷浓度仍会超过有效血药谷浓度范围。临床上需要对其进行血药谷浓度监测，并根据监测结果和疗效来调整药物的使用剂量，从而提髙其疗效同时降低不良反应的发生。药物的代谢主要受药物代谢酶影响，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶 (uridine diphosphoglucuronyl transferase，UGT)是丙戊酸相代谢酶。UGT A541G基因具有多态性而导致酶的活性改变，UGT1A6 A541G基因多态性可能通过影响酶的活性而影响丙戊酸钠的血药谷浓度[1]。本研究旨在调查UGT1A6 A541G基因多态性在癫痫患儿中的分布，探讨基因多态性与丙戊酸钠血药谷浓度个体差异的关系。

1资料和方法

1.1研究对象

收集西安交通大学第二附属医院儿科2015年11月至2016年4月住院癫痫患儿相关临床资料。纳入标准：服用丙戊酸钠口服液且已完善UGT A541G基因多态性分析、丙戊酸钠血药谷浓度检测。排除标准：口服两种及以上抗癫痫药物；联合生酮饮食治疗；联合激素治疗；检测血药浓度期间合并肝、肾功能检测异常；合并其他遗传代谢疾病。

共收集67例活动性癫痫患儿资料，其中男性患儿38人，女性患儿29人，最小年龄2岁，最大年龄13岁；服用丙戊酸钠的剂量为10～30mg·kg-1·d-1，分3次服用，服用丙戊酸钠的总疗程为5天至3年。

1.2标本采集

服药至少5个半衰期后，丙戊酸钠血药谷浓度达到稳态时采集静脉血，早晨空腹服药前采静脉血4mL，其中2mL置普通试管以测定丙戊酸钠血药谷浓度,另外2mL置无菌无酶的EDTA抗凝试管中4℃保存。

1.3尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A6 A541G基因多态性检测

1.3.1人血标本DNA提取

采用全血基因组DNA提取试剂盒提取DNA，提取结束后加入预热65℃洗出液150μL溶解DNA，放置过夜，待用。

1.3.2聚合酶链反应

设计并合成UGT1A6 A541G扩增和测序的引物，按如下条件进行PCR扩增：PCR体系50μL。10×PCR反应缓冲液5μL，三磷酸脱氧核糖核酸(dNTP)4μL(各10mmol/L)，蒸馏水37.5μL，正向引物和负向引物各0.5μL(100μmol/L)，rTaq DNA多聚酶0.5μL(5IU/μL)，基因组DNA2.0μL(20～30μg/L)。PCR条件为94℃预变性10min，变性、退火和延伸分别为94℃30s、55℃30s和72℃45s，共50个循环，最后72℃延伸 7min，最后在4℃保温。取扩增产物5μL和上样缓冲液1μL混匀，在2%琼脂糖电泳，可获得清晰的扩增产物[2]。

1.3.3焦磷酸测序

①测序引物退火缓冲液的配制：将10μmol/L测序引物工作液1μL加入24μL退火缓冲液中，得到0.4μmol/L测序引物退火缓冲液。测序板上每个孔加入测序引物退火缓冲液25μL；②配置单链DNA分离液：2μL磁珠和40μL结合缓冲液，加高纯水18μL配置成60μL单链DNA分离液；③PCR产物固定：每个PCR样本20μL加入60μL单链DNA分离液，在常温下剧烈振荡10min，使得亲和素包被的磁珠与生物素标记的单链充分结合；④单链DNA模板的制备：在真空工作站中，1号位加入70%乙醇50mL，2号位加入变性缓冲液40mL，3号位加入洗液50mL，4号位加入高纯水50mL，5号位加入高纯水70mL，打开真空泵，将真空工具在6号位清洗15s，移动到PCR板吸附磁珠15s，依次在1、2、3号位清洗5s、5s、10s；⑤引物杂交：将真空工具真空阀关闭，放入含有测序引物的板中，充分摇动释放磁珠，在80℃杂交2min，室温静置5min冷却；⑥测序：使用焦磷酸测序仪和测序通用试剂盒，按仪器和试剂说明书进行PCR产物的SNP位点的焦磷酸测序[2]。

1.4丙戊酸钠血药谷浓度测定及其标准化

气相色谱法测定丙戊酸钠血药谷浓度(μg/mL)。为消除体重及服药剂量对血药谷浓度的影响，将气相色谱法所测得血药谷浓度除以患儿每日每千克体质量的服药量(mg/kg)，即标准化的血药谷浓度[3]。

1.5统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件处理分析数据。统计分析数据用均值±标准差表示，UGT1A6 541位点的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡及基因多态性分布的差异用χ2检验[4]，UGT1A6 541位点A/A、A/G、G/G基因型间血药谷浓度差异的分析用t检验，检验水准取α=0.05。定义P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1研究对象的基因型分析

67例癫痫患儿A、G的等位基因频率分别为85.8%和14.2%，其基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=1.84，P>0.05)。67例患儿UGT1A6 541位点基因型为A/A者49例(73.1%)，A/G者17例(25.4%)，G/G者1例(1.5%)。

2.2基因多态性与丙戊酸钠标准血药谷浓度的关系

UGT1A6 541位点A/A基因型与含有UGT1A6 541位点G等位基因的患儿丙戊酸标准血药谷浓度的比较：根据上述基因分型将UGT1A6 541野生型(即A/A基因型)的患儿作为A组，含UGT1A6 541突变型的患儿(包括A/G者和G/G者)作为B组。B组患儿丙戊酸钠的标准血药谷浓度均值(3.43±0.38)mg/mL较A组(4.13±0.21)mg/mL低，见表1。

分组例数(n) 性别 男(n)女(n)标准血药谷浓度平均值(mg/mL)A组4927224．13±0．21B组181173．43±0．38

3讨论

虽然血药谷浓度监测对临床个体化给药起着一定的作用，但不能在用药前预测机体对药物的反应，常需频繁监测血药谷浓度间接了解患儿的药物代谢水平，造成初始加量时间偏长，长期维持剂量可能波动较大，药物基因组学为个体化给药的尝试提供了一个新的方法。分析患者的药物基因组学，结合病人的病理生理特征、临床表型，制定合理、安全、有效的用药方案，真正做到个体化给药，达到药物有效性及安全性目的，是未来精准医疗的一个方向。

3.1尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A6 A541G基因多态性检测有助于指导癫痫儿童丙戊酸钠使用

丙戊酸经胃肠道吸收，随血流透过血脑屏障作用于神经元相应的靶点，大部分由肝脏代谢，包括与UGT结合，主要由肾脏排出体外，整个过程涉及受体及各种酶的基因变异，从而影响药物的吸收、分布和代谢，最终影响药物的临床疗效[5]。葡萄糖醛酸基转移酶作为肝脏重要的代谢酶，其基因多态性研究近来备受关注，本研究中癫痫患儿中UGT1A6 A541G多态性的分布结果，A541G位点突变发生率为26.9%，与亚裔人群的突变频率基本一致，与非裔美国人群的突变频率也基本一致[6-7]。目前研究认为尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(UGT)基因的杂合子突变型及突变型可加快药物的代谢与排泄，从而造成携带UGT1A6突变基因型的患者体内标准血药谷浓度较野生基因型低[7-8]，对指导临床合理、安全、个体化调整药物有一定作用。本研究结论与相关文献报道相一致，支持含有UGT1A6 A541G等位基因的患儿加快了药物的代谢与排泄，从而在临床使用丙戊酸钠时应较常规加大用量。

3.2现阶段临床应用尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A6 A541G基因多态性检测的局限性

丙戊酸的代谢过程相当复杂，除UGT1A6参与丙戊酸的代谢过程外，UGT1A9、UGT2B7等其他 Ⅱ相代谢酶也有协同效应，丙戊酸代谢也受到诸如CYP2A6、CYP2B6Ⅰ相代谢酶及脂肪酸结合蛋白的影响[4,9]。诸如年龄、种族、营养状况(血浆蛋白水平)以及胃、肠、肝、肾功能等因素对药物吸收、分布、代谢、排泄的影响较大，进而影响丙戊酸钠血药浓度。含有UGT1A6 A541G等位基因的患儿使用丙戊酸钠时较常规增大用量的具体数值尚需摸索。因此目前基因多态性检测结果指导抗癫痫治疗方案调整尚待进一步深入研究。

综上所述，本实验中携带UGT1A6突变基因型的患儿体内标准血药谷浓度较野生基因型低，支持含有UGT1A6 A541G等位基因的癫痫患儿丙戊酸钠代谢与排泄速率加快，提示含有UGT1A6 A541G等位基因的患儿口服丙戊酸钠应高于常规用量。

[1]Chatzistefanidis D, Lazaros L, Giaka K,etal. UGT1A6- and UGT2B7-related valproic acid pharmacogenomics according to age groups and total drug concentration levels[J]. Pharmacogenomics,2016,17(8):827-835.

[2]刘娜,张抗怀,苏燕胜,等.基因分型指导非瓣膜性房颤患者华法林抗凝治疗的研究[J].中国医院药学杂志,2016,36(8):654-658.

[3]Chatzistefanidis D, Georgiou I, Kyritsis A P,etal. Functional impact and prevalence of polymorphisms involved in the hepatic glucuronidation of valproic acid [J]. Pharmacogenomics,2012,13(9):1055-1071.

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[5]Munisamy M, Tripathi M, Behari M,etal. The effect of uridine diphosphate glucuronosyltransferase (UGT)1A6 genetic polymorphism on valproic acid pharmacokinetics in Indian patients with epilepsy: a pharmacogenetic approach [J]. Mol Diagn Ther,2013,17(5):319-326.

[6]Jalil N J, Bannur Z, Derahman A,etal. The Implication of the Polymorphisms of COX-1, UGT1A6, and CYP2C9 among Cardiovascular Disease (CVD) Patients Treated with Aspirin[J]. ournal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences,2015,18(3):474-483.

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[9]Wang Q, Zhao L, Liang M,etal. Effects of UGT2B7 Genetic Polymorphisms on Serum Concentrations of Valproic Acid in Chinese Children With Epilepsy Comedicated With Lamotrigine[J]. Ther Drug Monit,2016,38(3):343-349.

[专业责任编辑：周戬平]

Effect of UGT1A6 A541G genetic polymorphism on serum concentration of sodium valproate in children with epilepsy

JIANG Yong-sheng, YANG Lin

(Department of Pediatrics, Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Shaanxi Xi’an 710004, China)

Objective To evaluate the effect of uridine diphosphoglucuronyl transferase (UGT) 1A6 A541G genetic polymorphism on serum concentration of sodium valproate. Methods Venous blood of epileptic children with serum concentration of sodium valproate reaching steady state after at least 5 half-lives was collected. Target gene was amplified by PCR after whole blood genomic DNA extraction, and UGT1A6 A541G gene polymorphism was detected by pyrosequencing. Method of gas chromatography was used to assay serum concentration of sodium valproate. Results The genotypic frequencies of UGT1A6 A541G were as follows: A/A in 49 cases (73.1%), A/G in 17 cases (25.4%) and G/G in 1 case (1.5%). According to the genotypes of UGT1A6 A541G the patients were divided into two groups, group A (A/A) and group B (A/G and G/G). Mean value of serum concentration of sodium valproate of patients in group A (4.13±0.21mg/mL) was higher than that in group B (3.43±0.38mg/mL) with statistical significance (t=2.51,P<0.05).Conclusion The genetic polymorphism of UGT1A6 A541G affects metabolism and excretion of sodium valproate, which indicates that the dosage of sodium valproate for patients with UGT1A6 A541G allele should be higher than usual.

UGT1A6 A541G genetic polymorphism; sodium valproate; epilepsy; children

2016-6-20

姜永生(1984-)，男，住院医师，硕士，主要从事儿童癫痫临床诊疗。

杨 琳，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.12.032

R725

A

1673-5293(2016)12-1526-03