烟草乙烯反应突变体的抗冷性及机理分析

赵宇航，李凤明，张 弢，侯晓敏，杨洪兵，董春海

(青岛农业大学 生命科学学院，山东省高校植物生物技术重点实验室，山东 青岛 266109)

烟草乙烯反应突变体的抗冷性及机理分析

赵宇航，李凤明，张 弢，侯晓敏，杨洪兵，董春海

(青岛农业大学 生命科学学院，山东省高校植物生物技术重点实验室，山东 青岛 266109)

为了深入研究乙烯在植物抵抗逆境胁迫中的作用，以烟草为模式植物，利用幼苗对外源乙烯的“三重反应”，筛选得到了40多个乙烯不敏感突变体，其中多数突变体具有较强的抗冷性；从中选取4个突变体株系，对它们耐受低温胁迫的生理基础和作用机理进行了分析。结果表明，低温(0 ℃)胁迫下，烟草乙烯不敏感突变体的电解质渗透率显著低于野生型，而抗氧化酶活性(POD、SOD)以及过氧化氢酶(CAT)活性都高于野生型，说明突变体具有抵抗低温胁迫的优势生理基础。进一步研究发现，低温(0 ℃)胁迫下，烟草突变体中冷诱导基因NtCBFs和NtCOR47呈现高水平表达，乙烯信号传导途径中下游基因ERFs的表达也发生显著变化。这些研究为烟草乙烯不敏感突变体株系具有较强的抗冷性提供了直接的分子证据。

烟草；低温胁迫；乙烯；抗冷性；突变体

植物与其他多细胞复杂生物体的显著区别在于植物营固着生活，因而在植物的生活周期中被迫接受各种各样的不利环境，如土壤盐害、干旱、低温、病原物侵袭、机械损伤等。逆境胁迫中，低温是影响植物自然分布的主要限制因子，不仅限制作物的种植范围，而且还会造成作物减产和品质下降，几乎每年都会对农业生产造成巨大损失，严重时甚至绝收。研究表明，植物响应低温胁迫中的基因表达及分子调控在植物耐受低温胁迫中起关键作用[1-3]，但如何利用生物技术提高植物的抗冷、抗冻性，人们所知甚少。

烟草喜温暖而湿润的气候，属温度敏感型植物，对低温甚为敏感。我国烟区分布广泛，各地温度条件差异很大，比如早春低温危害是我国南方烟区普遍存在的问题。在北方烟区，由于缺乏必要的灌溉条件，每年总有一些烟区因土壤干旱而影响烟株生长从而造成烟叶的产量和品质降低。烟草作为一种模式作物，其生长发育及基因育种方面的相关研究也日益受到人们的关注。前期工作中，笔者利用烟草乙烯不敏感突变体研究其耐旱性及其作用机制[4]，但烟草突变体的抗冷性及其分子机制尚未报道。

乙烯是气体植物激素，不仅参与植物的生长发育、果实成熟、器官衰老等生物过程，乙烯也在植物应答生物胁迫和非生物胁迫反应中发挥至关重要的作用[5]。乙烯在植物应答逆境胁迫刺激时可以快速灵敏地形成应激反应，乙烯敏感性的改变往往影响植物的抗逆性，例如，改变转基因烟草的乙烯信号调控因子影响植株的耐盐性[6]；拟南芥的乙烯突变体(etr1-1、ein4-1、ein3-1)对低温有一定的抗性[7]；在烟草或番茄中过表达乙烯信号传导途径下游的ERFs基因可提高转基因植物对盐、干旱及低温胁迫的耐受性[8-13]。本课题组利用烟草幼苗对乙烯特有的“三重反应”，利用甲基磺酸乙酯(EMS)化学诱变获得的突变体群体中筛选乙烯不敏感突变体。其中，大部分烟草乙烯不敏感突变体对低温、干旱等逆境胁迫表现出明显的抗性[4，14]。本研究旨在对烟草乙烯不敏感突变体的抗冷性进行深入分析，了解它们耐受低温胁迫的生理机制以及应答的分子基础等。这些分析不仅对研究植物的乙烯反应与抗逆性之间的关联具有理论指导意义，所获得的突变体株系在生产中亦具有直接的应用价值。

1 材料和方法

1.1 试验材料

烟草种子由中国农科院烟草研究所提供，包括野生型中烟100和经过EMS诱变的中烟100的二代突变体种子 (突变体编号为该项课题使用的统一号码)。

烟草种子使用1%的NaClO溶液(V/V)消毒50～60 min，无菌吐温水振荡1 min后再清洗6次，晾干后点播于MS培养基上。4 ℃放置3 d后，置于光照培养箱中光照培养(16 h光照/8 h黑暗，25 ℃)；无光照培养即在光照培养箱培养12 h后转为黑暗培养。

1.2 试验方法

1.2.1 烟草乙烯不敏感突变体筛选 将EMS诱变的烟草突变体二代种子进行表面消毒，然后将消毒后的种子单粒点播于附加100 μmol/L ACC(Sigma Aldrich)的MS培养基上。4 ℃黑暗条件下放置3 d后，转移到光照培养箱内培养10 h，然后用锡箔纸包起来于培养室25 ℃ 暗培养 6～7 d后取出，选取下胚轴长且没有明显顶钩的株系转移到MS培养基上光照培养。待幼苗生长茁壮后，移栽于营养土中。

1.2.2 烟草乙烯不敏感突变体的抗冷性筛选及分析 烟草乙烯不敏感突变体的抗冷性筛选：将筛选得到的烟草乙烯不敏感突变体种子点播于MS培养基上，4 ℃ 低温处理3 d后进行光照培养12 h，然后置于4 ℃ 低温环境下无光照培养60 d。取出后，根据突变体与野生型幼苗的下胚轴伸长与主根生长的差异，筛选出抗冷性突变体株系。

烟草乙烯不敏感突变体的抗冷性分析：烟草突变体种子点播于MS培养基上，4 ℃ 低温处理3 d后光照培养12 h，分别置于8，15，25 ℃ 3个温度条件下培养，每个温度条件下均设置光照培养与无光照培养2个处理。每个处理各选取合适培养时间，培养一定时间后观察、对比突变体与野生型幼苗的下胚轴伸长与主根生长的差异，以此初步分析突变体株系的抗冷性。

1.2.3 抗冷性相关生理指标测定 细胞膜透性检测：将烟草乙烯不敏感突变体株系(C1、C2、C3、C4)及野生型(WT)的种子分2组(试验组和对照组)点播于MS培养基上，在正常条件下培养21 d，对照组继续在培养箱中培养，试验组放置在冰上(0 ℃)处理12 h，以DDS-11A电导仪测定低温胁迫后植株叶片电解质的电导率。根据电解质渗漏率=L1/L2×100%进行计算，其中L1为煮沸前的电导率，L2为煮沸冷却后的电导率。试验结果为3次重复的平均值 ± 标准差(SD)，用SPSS数据处理系统对测定结果进行方差分析(P<0.05)。

生理活性物质检测：超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性采用氮蓝四唑(NBT)法，过氧化物酶(Peroxidase，POD)活性采用愈创木酚法，过氧化氢(Hydrogen peroxide，H2O2)含量采用紫外分光光度计检测法测定，过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性采用高锰酸钾滴定法测定，脯氨酸(Proline，Pro)含量采用酸性茚三酮法测定[15-16]。试验均重复3次，试验结果为3次重复的平均值±标准差(SD)，经SPSS数据处理系统对测定结果进行统计分析，计算平均值，并进行方差分析及差异显著性分析。

1.2.4 低温诱导基因表达的实时定量qRT-PCR检测 不同株系的烟草突变体及野生型在正常光照培养条件下生长21 d，置于0 ℃ (放置冰上)黑暗处理0，1，3，6，12，24 h后，将幼苗取出并洗净培养基残留物，液氮速冻并存于-80 ℃ 冰箱中留用。qRT-PCR所用仪器(Agileng，Mx3000P)、反应体系(SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ，TaKaRa Bio Inc，Otsu，Japan)等参见Wang等[4]。

2 结果与分析

2.1 依据乙烯“三重反应”筛选烟草突变体

烟草种子在附加乙烯前体物ACC (100 μmol/L)的MS培养基上无光照培养 6～7 d，通过分析幼苗的乙烯“三重反应”，从2 000个M2的突变体株系中筛选得到了41个乙烯不敏感的烟草突变体株系，其中大部分突变体对干旱、低温等逆境胁迫表现出明显的抗性[4]。本试验选取其中4个株系(C1、C2、C3、C4)，对其抗冷性及抗冷机理进行深入研究。

突变体4个株系(C1、C2、C3、C4)及野生型(WT)幼苗的乙烯“三重反应”如图1-A、1-B所示，在无光照条件下，附加ACC (100 μmol/L)的培养基上野生型烟草幼苗表现出典型的“三重反应”特征：幼苗主根生长受到抑制，下胚轴缩短变粗，子叶形成特别的顶钩；相比较，突变体株系的“三重反应”特征不完整，特别是顶钩弯曲(Aggregated apical hook)消失、下胚轴伸长不受抑制、主根有不同程度的生长等，简称为乙烯不敏感突变体(Ethylene insensitive mutant)。试验表明，这些突变体株系的M3、M4、M5后代均显示相同的乙烯“三重反应”特征，说明突变体性状能够稳定遗传[4]。

A.烟草幼苗生长状况(0，100 μmol/L ACC；暗培养6 d)，bars=1 cm；B.烟草幼苗的下胚轴长度测量分析(P<0.05)，0，100 μmol/L ACC处理分别进行了分析(柱形图上方a,b,c, d等字母表示one-way ANOVA统计学分析，P<0.05)。

A.Growth status of tobacco seedlings(0，100 μmol/L ACC；6 days in darkness)，bars=1 cm；B.Hypocotyl length of tobacco seedlings.Lower letters above columns indicate significant differences in 0，100 μmol/L ACC treatment，respectively (one-way ANOVA，P<0.05).

图1 烟草幼苗的乙烯“三重反应”
Fig.1 Ethylene “triple response” of tobacco seedlings in darkness

图中数据为3次重复的平均值±标准差(SD)；*.P<0.05。图8同。Data shown are means±SD(n=3)；*.P<0.05.The same as Fig.8.

2.2乙烯信号下游ERFs基因在烟草突变体中高水平表达

为了了解上述4个烟草乙烯反应突变体中ERFs的基因表达，选取6个烟草ERF基因(NtERF1、NtERF2、NtERF3、NtERF4、NtERF5、NtERF6)分析了其内源表达水平以及在低温胁迫下的基因表达情况。如图2所示，在没有低温胁迫的情况下，烟草乙烯不敏感突变体中的NtERF2、NtERF3、NtERF4、NtERF5和NtERF6的表达量显著高于野生型 (图2-B-F)。低温处理(0 ℃)不同时间(1，3，6，12，24 h)后，野生型烟草中的NtERF1和NtERF5的表达量没有显著变化，而NtERF2、NtERF3、NtERF4和NtERF6的表达量显著提高(图2-B、C、D、F)。与野生型相比，突变体株系C1的NtERF1(图2-A)、NtERF4(图2-D)和NtERF5 (图2-E)的表达量明显提高；突变体株系C2、C3的NtERF2(图2-B)和NtERF4 (图2-D)的表达量明显提高；突变体株系C4的NtERF3(图2-C)、NtERF5(图2-E)和NtERF6 (图2-F)的表达量明显提高。试验结果表明，烟草突变体中高水平表达ERFs可能有助于提高植株的抗逆性。

2.3 烟草乙烯反应突变体的抗冷性分析

对前期筛选获得M3的 41个烟草乙烯不敏感突变体株系进行抗冷性分析，与野生型相比，其中24个表现为较强的抗冷性。选取其中4个突变体株系(C1、C2、C3、C4)，进一步观察、测量低温黑暗条件下幼苗的下胚轴伸长和主根生长，比较分析不同温度条件下(4，8，15，25 ℃)黑暗培养的幼苗生长情况，结果表明(图3-A)，正常温度(25 ℃)条件下培养7 d，4个突变体株系的下胚轴长均短于野生型，而主根长度与野生型相比相差不大(图3-A)；温度降至15 ℃，处理14 d，突变体株系的下胚轴长度与野生型下胚轴长度稍优于野生型，而突变体株系的主根长度显著优于野生型(图3-B)；在8 ℃ 低温条件下处理21 d，突变体株系的下胚轴及主根长度均显著大于野生型(图3-C)。当温度降至4 ℃ ，幼苗生长极其缓慢，无光照培养2个月后，所有突变体株系的下胚轴长度与部分突变体株系(C2、C3、C4)主根长度亦显著优于野生型(图3-D)。

烟草幼苗黑暗条件下的下胚轴长度及主根长度测量分析 (A.25 ℃; B.15 ℃; C.8 ℃; D.4 ℃)。柱形图上方a,b,c, d等字母表示one-way ANOVA统计学分析，P<0.05。

在低温、光照条件下培养(16 h 光/8 h 暗、光强100 μmol/(m2·s)，烟草乙烯不敏感突变体株系的幼苗生长均较野生型生长状况好，叶片肥大，主根粗壮发达，侧根相对丰富，幼苗鲜质量与根长均显著优于野生型(图4)。而正常温度(25 ℃)条件下，突变体与野生型长势近似，鲜质量及根长与野生型并无显著差异(图4-A-C)。

A～C.正常温度(25 ℃)条件下烟草幼苗的生长状况、鲜质量及主根长度测量分析；D～F.低温(15 ℃)条件下烟草幼苗的生长状况、鲜质量及主根长度测量分析；G～I.低温(8 ℃)条件下烟草幼苗的生长状况、鲜质量及主根长度测量分析；bar=1 cm，柱形图上a,b,c,d等字母表示one-way ANOVA统计学分析，P<0.05。Growth status (A，D and G)，fresh weight (B，E and H) and primary root length (C，F and I) of tobacco seedlings under different temperature (A-C.25 ℃；D-F.15 ℃；G-I.8 ℃).Lower letters above columns indicate significant differences (one-way ANOVA,P< 0.05).

2.4 烟草乙烯反应突变体抗性生理生化指标的分析

细胞膜系统是遭受低温伤害的首要部位，低温处理对电解质渗透率的影响可以作为植物抗冷性的一项重要生理指标。如图5所示，25 ℃ 正常温度条件下，野生型与突变体幼苗叶片的电解质渗透率变化较小。在低温(0 ℃)处理12 h后，4个烟草乙烯不敏感突变体株系的叶片的相对电导率显著低于野生型的相对电导率(图5)，说明烟草乙烯不敏感突变体植株具有较强的抗冷性。

另外，低温(0 ℃)处理12 h后，各突变体的抗氧化酶(SOD和POD)活性均显著高于野生型，其中突变体株系C3、C4较为突出(图6-A、6-D)。低温(0 ℃)处理后，各突变体的H2O2含量(以鲜质量计)均显著低于野生型(图6-B)；各突变体的CAT活性(以鲜质量计)均显著高于野生型，其中突变体C2较为突出(图6-C)。相比较，低温(0 ℃)处理后，突变体的脯氨酸含量与野生型相差异较小，但整体仍高于野生型(图6-F)。

不同小写字母表示5%水平上差异显著。Different letters represents significant difference at 0.05 level.

图中数据为3次重复试验的平均值 ± 标准差(SD)。柱形图上方a,b,c, d等字母表示one-way ANOVA统计学分析，P<0.05。Error bars represent ±SD (n=3). Lower letters above columns indicate significant differences (one-way ANOVA,P< 0.05).

2.5 烟草乙烯反应突变体中低温诱导基因及其表达分析

为了进一步了解烟草乙烯不敏感突变体中低温诱导基因的表达情况，利用核苷酸同源序列比对的方法从烟草基因组数据库中获得了3个烟草CBF基因(NtCBF1，NtCBF2，NtCBF3)和1个烟草COR基因(NtCOR47)的核苷酸序列，并对其编码的氨基酸序列与拟南芥中的同源基因进行了比较分析(图7)；同时进一步分析了其内源表达水平以及在低温胁迫下的基因表达水平，如图8所示，低温(0 ℃)处理使不同的冷诱导基因的表达量均相对提高。但是未经低温处理，烟草突变体株系的冷诱导基因的相对表达量也普遍高于野生型。低温处理(0 ℃)不同时间后(1，3，6，12，24 h)，冷诱导基因表达量均大幅度提高，其中突变体株系C1中所测定的4个冷诱导基因的表达量在低温处理6 h后明显高于野生型，突变体株系C4中的NtCBFs(图8-A-C)和NtCOR47(图8-D)的表达量在低温处理1 h时显著高于野生型，突变体株系C2和C3中的NtCOR47的表达量在低温处理3～24 h时明显高于野生型。上述分析结果表明，不同突变体株系的冷诱导基因的表达模式不同，冷诱导基因的高水平表达为其抗冷性提供了证据。

图7 烟草NtCBFs与拟南芥AtCBFs基因的系统发生关系(A)及AtCOR47与AtCOR47的同源性比较(B)Fig.7 Phylogenetic comparison between NtCBFs and AtCBFs genes(A) & Homology comparison between NtCOR47 and AtCOR47(B)

图8 低温胁迫(0 ℃)对烟草乙烯不敏感突变体冷诱导基因表达的影响Fig.8 Effect of cold stress (0 ℃) on the cold-induced gene expressions in tobacco ethylene insensitive mutants

3 讨论

乙烯是只有碳和氢(C2H4)构成的气体小分子，但在植物生长发育过程中及逆境胁迫反应中起着关键的调节作用。长期以来，相关研究人员利用模式植物拟南芥在复杂的乙烯反应和信号传导途径的分子调控方面取得了重要进展[17-18]。相比较，乙烯在植物应答逆境胁迫反应的生理机制以及分子机理方面研究较少[5]。本研究从烟草幼苗的乙烯敏感性入手，利用筛选获得的乙烯不敏感突变体株系，分析其抗冷性以及相关的分子基础，为利用生物技术开展分子育种提供了新思路。

通过对41个烟草乙烯不敏感突变体株系的抗冷性分析，其中24个表现为较强的抗冷性，说明植物的乙烯不敏感性与抗冷性密切关联。这种关联性在模式植物拟南芥中亦有报道，Shi等[7]发现拟南芥的乙烯不敏感突变体(etr1-1、ein4-1、ein3-1)对低温胁迫有一定的抗性。本研究选取4个烟草突变体株系，深入分析了它们耐受低温胁迫的生理基础和分子机理。在如下几个方面得到了抗冷性的支持证据：① 低温(0 ℃)处理12 h后，4个烟草乙烯不敏感突变体株系的相对电导率显著低于野生型的相对电导率，说明突变体株系的细胞膜系统对低温伤害具有较强的抵抗性；②突变体株系在低温胁迫下，抗氧化酶活性(POD、SOD)以及CAT活性都高于野生型，而过氧化氢含量则低于野生型，说明烟草乙烯不敏感突变体株系具有抵抗低温胁迫的生理基础，突变体植株比野生型更能适应低温环境；③低温处理(0 ℃)不同时间后(1，3，6，12，24 h)，虽然不同突变体株系的基因表达模式不尽相同，但4个突变体株系的冷诱导基因(NtCBF1、NtCBF2、NtCBF3、NtCOR47)的表达量均呈现不同程度的高表达，为烟草乙烯不敏感突变体株系具有较强的抗冷性提供了直接的分子证据。

研究中发现，未经低温处理的烟草乙烯不敏感突变体株系的冷诱导基因，其相对表达量也明显高于野生型。在没有低温胁迫下，烟草乙烯不敏感突变体株系中大部分的乙烯信号传导途径中的下游基因ERFs的表达量也高于野生型。有理由相信，烟草乙烯不敏感突变体中较高水平的ERFs可能与相关冷诱导基因的高水平表达密切相关。突变体中，冷诱导基因与乙烯信号传导途径中基因的分子相互调控作用仍需进一步研究。

乙烯信号传导途径中下游的ERFs是AP2 (Apetala2)/ERF 转录因子家族中最大的1个亚族，是植物特有的一类具有1个保守的ERF型DNA结合域的转录因子[19]。烟草中至少有239个ERF基因，包括10个亚族，其同源基因在拟南芥和水稻等植物中广泛存在[20]。ERF转录因子除了结合GCC-box调控植物对病原生物的响应外，还可以结合非GCC-box顺式作用元件参与植物对低温、干旱等非生物胁迫相关的应答过程。通过转基因技术已经证明，在烟草中过表达乙烯信号下游的ERFs能增强转基因植株对盐、干旱及低温胁迫的耐受性[8-13]。最近研究表明，烟草乙烯不敏感突变体中存在较高水平的ERFs，具有较强的耐旱能力[4]。本研究烟草乙烯不敏感突变体中存在较高水平的ERFs，与上述研究一致。

综上所述，本研究利用遗传诱变创制并筛选出烟草乙烯不敏感突变体株系，并对其较强的抗冷性在生理及分子机理方面进行了深入分析，从细胞膜的电解质渗透性、抗氧化酶活性以及突变体植株的冷诱导基因表达以及乙烯信号下游的ERFs转录水平的分析等诸多方面，阐释了突变体抗冷性的分子基础，为研究植物的乙烯反应与非生物胁迫的关系提供了新证据，也为利用生物技术改良作物的抗逆性奠定了理论基础。

[1] Zhu J，Dong C H，Zhu J K.Interplay between cold-responsive gene regulation，metabolism and RNA processing during plant cold acclimation[J].Current Opinion in Plant Biology，2007，10(3)：290-295.

[2] Miura K，Furumoto T.Cold signaling and cold response in plants[J].International Journal of Molecular Sciences，2013，14(3)：5312-5337.

[3] Dong C H，Pei H X.Over-expression of miR397 improves plant tolerance to cold stress inArabidopsisthaliana[J].Journal of Plant Biology，2014，57(4)：209-217.

[4] Wang H，Wang F，Zheng F，et al.Ethylene-insensitive mutants ofNicotianatabacumexhibit drought stress resistance[J].Plant Growth Regulation，2016，79(1)：107-117.

[5] Wang F，Cui X，Sun Y，et al.Ethylene signaling and regulation in plant growth and stress responses[J].Plant Cell Reports，2013，32(7)：1099-1109.

[6] Cao W H，Liu J，He X J，et al.Modulation of ethylene responses affects plant salt-stress responses[J].Plant Physiology，2007，143(2)：707-719.

[7] Shi Y，Tian S，Hou L，et al.Ethylene signaling negatively regulates freezing tolerance by repressing expression of CBF and type-A ARR genes inArabidopsis[J].The Plant Cell，2012，24(6)：2578-2595.

[8] 刘文奇，陈旭君，徐晓晖，等.ERF类转录因子OPBP1基因的超表达提高烟草的耐盐能力[J].植物生理与分子生物学学报，2002，28(6)：473-478.

[9] Wu D，Ji J，Wang G，et al.LchERF，a novel ethylene-responsive transcription factor fromLyciumchinense，confers salt tolerance in transgenic tobacco[J].Plant Cell Reports，2014，33(12)：2033-2045.

[10] Zhang G，Chen M，Li L，et al.Overexpression of the soybean GmERF3 gene，an AP2/ERF type transcription factor for increased tolerances to salt，drought，and diseases in transgenic tobacco[J].Journal of Experimental Botany，2009，60(13)：3781-3796.

[11] Zhang Z，Li F，Li D，et al.Expression of ethylene response factor JERF1 in rice improves tolerance to drought[J].Planta，2010，232(3)：765-774.

[12] Wu L，Chen X，Ren H，et al.ERF protein JERF1 that transcriptionally modulates the expression of abscisic acid biosynthesis-related gene enhances the tolerance under salinity and cold in tobacco[J].Planta，2007，226(4)：815-825.

[13] Wang X，Han H，Yan J,et al.A new AP2/ERF transcription factor from the oil plantJatrophacurcasconfers salt and drought tolerance to transgenic tobacco[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2015，176(2)：582-597.

[14] 刘贯山.烟草突变体筛选与鉴定方法篇：1烟草突变体的筛选与鉴定[J].中国烟草科学，2012，33(1)：102-103.

[15] Ali M B，Chun H S，Lee C B.Response of antioxidant enzymes in rice (OryzasauvaL.cv.Dongjin) under Mercury stress[J].Journal of Plant Biology，2002，45(3)：141-147.

[16] Shi H，Wang Y，Cheng Z，et al.Analysis of natural variation in bermudagrass (Cynodondactylon) reveals physiological responses underlying drought tolerance[J].PLoS One，2012，7(12)：e53422.

[17] Guo H，Ecker J R.The ethylene signaling pathway：new insights[J].Current Opinion in Plant Biology，2004，7(1)：40-49.

[18] Kendrick M D，Chang C.Ethylene signaling：new levels of complexity and regulation[J].Current Opinion in Plant Biology，2008，11(5)：479-485.

[19] Okamuro J K，Caster B，Villarroel R，et al.The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA binding proteins inArabidopsis[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1997，94(13)：7076-7081.

[20] Rushton P J，Bokowiec M T，Han S，et al.Tobacco transcription factors：novel insights into transcriptional regulation in the Solanaceae[J].Plant Physiology，2008，147(1)：280-295.

Chilling Tolerance Analysis of Ethylene Responsive Mutants in Tobacco

ZHAO Yuhang，LI Fengming，ZHANG Tao，HOU Xiaomin，YANG Hongbing，DONG Chunhai

(College of Life Sciences，Qingdao Agricultural University，Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province，Qingdao 266109，China)

To study the regulatory function of ethylene in plant stress tolerance，over 40 ethylene insensitive tobacco mutants were obtained from a genetic screen based on the typical seedling phenotype to ethylene in darkness，named "triple response"，and most of the mutants displayed chilling resistance.The present study chose 4 mutant strains for further analyses in their chilling tolerance，physiological basis，and cold-regulated gene expressions.Under low temperature (0 ℃) stress，the electrolyte permeability of the tobacco ethylene insensitive mutants was significantly lower than that of the wild type，while the activities of SOD，POD and catalase were higher than those of the wild type.Further study indicated that the cold-induced genes showed highly transcription level under low temperature (0 ℃) stress. And，the transcripts levels of the downstreamERFsin the ethylene signal transduction pathway in the mutants were altered in the tobacco mutants.These data provide a direct molecular evidence for the strong resistance of the tobacco ethylene insensitive mutants to chilling stress.This study not only provides a new evidence for the relationship between ethylene signaling and chilling stress，but also lays a foundation for the use of biotechnology to improve crop stress resistance.

Tobacco；Cold stress；Ethylene；Chilling tolerance；Mutant

2016-06-21

中国烟草总公司子课题(110201301005 JY-05)；中国农科院烟草研究所子课题(2012JY-04-11)；国家自然科学基金项目(31370322；31571389)；山东省重点研发计划(2015GNC110012)

赵宇航(1991-)，男，山西太原人，在读硕士，主要从事植物逆境生理研究。赵宇航、李凤明、张弢为同等贡献作者。

董春海(1962-)，男，山东兖州人，教授，博士，主要从事植物信号转导及分子调控研究。

S572.01

A

1000-7091(2016)06-0111-08

10.7668/hbnxb.2016.06.018