利用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠

赵 勇，师长宏，赵 亚，辛智倩，刘佩娟，张彩勤，白 冰，白杰英，王 华，张 海

(1.第四军医大学实验动物中心，西安 710032;2.军事医学科学院实验动物中心，北京 100071; 3.安徽医科大学第一附属医院肿瘤科，合肥 230022)

研究报告

利用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠

赵 勇1，师长宏1，赵 亚1，辛智倩1，刘佩娟1，张彩勤1，白 冰1，白杰英2，王 华3，张 海1

(1.第四军医大学实验动物中心，西安 710032;2.军事医学科学院实验动物中心，北京 100071; 3.安徽医科大学第一附属医院肿瘤科，合肥 230022)

目的应用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。方法针对miRNA-29b1基因设计一段sgRNA，sgRNA和Cas9体外转录后显微注射至C57BL/6小鼠受精卵细胞。小鼠出生后取其基因组DNA进行测序以鉴定基因型，同时取小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器研磨后提取总RNA，通过real-time PCR分析miRNA-29b1在这些脏器中的表达。结果设计了20 bp的miRNA-29b1sgRNA并与Cas9一起进行了体外转录，显微注射小鼠受精卵细胞后获得miRNA-29b1基因突变小鼠。测序结果表明突变小鼠有两种基因型，一种为10 bp的缺失突变;另一种为22 bp的缺失突变，同时伴有3 bp的插入突变。与野生型小鼠相比，基因突变小鼠心、肝、脾、肺、肾等组织中miRNA-29b1表达量下降明显。结论应用CRISPR/Cas9技术成功构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。

CRISPR/Cas9;miRNA-29b1;基因敲除小鼠

在前期的研究中本课题组通过动物实验不仅发现miRNA-29b1在酒精肝中表达改变，而且观察到miRNA-29b1影响血管内皮细胞功能，其机制可能是miRNA-29b1提高血管内皮细胞通透性参与动脉粥样硬化的病理过程［5］。由于酒精性肝纤维化对人危害大，目前尚无有效方法对其预防和治疗，同时鉴于miRNA-29b1在酒精性肝损伤肝纤维化发病中的机制不明，本研究拟以CRISPR/Cas9技术敲除 C57BL/6小鼠中 miRNA-29b1基因，以研究miRNA-29b1基因在酒精性肝损伤及纤维化中功能。

1 材料和方法

1.1 动物及试剂

SPF级C57BL/6小鼠，4～6周龄，由第四军医大学实验动物中心提供(许可证号SCXK(军)2012 -0007)，6～8周龄 ICR小鼠购自于北京维通利华公司，两种小鼠均饲养于屏障级设施。RNA体外转录试剂盒及纯化试剂盒购自于 Ambion公司。sgRNA体外转录试剂盒由北京唯尚立德生物科技有限公司提供。Bbs I限制性内切酶购自于NEB公司，T4 DNA连接酶、dNTPs购自于 TaKaRa公司。pX330质粒由北京艾德摩公司馈赠。小鼠基因组DNA提取试剂盒由成都嘉诚生物科技有限公司提供，PCR产物纯化试剂盒购自于天根生物公司。

1.2 sgRNA设计及重组质粒构建

根据 Genbank上报道的小鼠 miRNA-29b1序列，将待敲除序列利用http://crispr.mit.edu网站进行分析，设计20 bp的sgRNA靶向序列(图1，大写为miRNA-29b1成熟区序列，涂红序列为PAM区)。以此为依据，合成一对引物 (mir29b-pX330-F: CACCgaggaagctggtttcatatgg，mir29b-pX330-R: AAACccatatgaaaccagcttcctc)进行重组质粒构建。各取2 μL上下游引物，以水补齐至20 μL，95℃ 作用5min进行退火，pX330质粒Bbs I单切后回收，退火产物以T4连接酶克隆至pX330质粒。

图1 sgRNA设计Fig.1 Diagram of sgRNA design

1.3 sgRNA和Cas9体外转录及纯化

几年前，我赢得了《洛杉矶时报》夏季摄影比赛的冠军，并开始接触国际摄影记者。住在越南会安时，我开启了自己的个人项目，我觉得每个摄影师都需要有自己的拍摄项目。

以上述pX330重组质粒为模板，通过含T7启动子的上下游引物(mir29b-3at-F:tTAATACGACT CACTATAGGgaggaagctggtttcatatggG，mir29b-3at-R:A AAAgcaccgactcggtgc)进行 PCR反应克隆 sgRNA基因序列，sgRNA基因序列以体外转录试剂盒进行转录、纯化。同时以pX330质粒为模板，通过PCR反应克隆Cas9基因，PCR产物纯化后进行体外转录，转录方法按试剂盒说明书进行。RNA转录产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后-80℃保存备用。

1.4 显微注射及受精卵细胞移植

雌性C57BL/6小鼠超数排卵后收集受精卵细胞。Cas9和sgRNA转录产物按2∶1比例混合，稀释后使其终浓度含100 ng/μL的Cas9和50 ng/μL的sgRNA。以Eppendorf TransferMan NK2显微操作装置将上述混合物注入收集的受精卵细胞胞质。注射后的受精卵细胞37℃培养2 h后移植到假孕的ICR母鼠。

1.5 敲除小鼠基因型鉴定

剪取出生1周新生小鼠尾巴，加入消化液后65℃作用30min进行小鼠基因组DNA提取，具体提取方法按试剂盒说明书进行。取 100 ng基因组DNA进行PCR反应以鉴定小鼠基因型。PCR反应条件为98℃预变性3 min，98℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃20 s，72℃ 3 min，共30个循环。

1.6 Real time PCR鉴定miRNA-29b1在敲除小鼠体内的表达

颈椎脱臼法处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾等组织匀浆后提取总 RNA，反转录后以 Real time PCR进行 miRNA-29b1表达检测。cDNA合成引物为GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAC CAGAGCCAACtaaacc，Real time PCR反应上游引物GATCgctggtttcatatggtgg，下游引物 GTGCAGGGTCC GAGGT。

2 结果

2.1 sgRNA及Cas9体外转录

以pX330重组质粒为模板，sgRNA上下游引物进行扩增反应，可得到大小约为120 bp的PCR产物(图2A)，同时通过 Cas9引物也可扩增到4 200 bp的PCR产物(图2B)。上述两种PCR产物纯化后在T7启动子介导下进行体外转录反应，转录产物经紫外分光光度计检测后 OD260/280＞1.9，OD260/230＞2.0。

2.2 miRNA-29b1敲除小鼠基因型鉴定

注射sgRNA及Cas9 mRNA的小鼠受精卵细胞移植受体ICR小鼠后，获得F0代首建鼠，F0代突变小鼠与野生型C57BL/6小鼠交配，获得F1代小鼠，F1代突变小鼠互交后获得两种基因型纯合子小鼠。提取小鼠基因组DNA进行测序鉴定，结果发现F0代有两种基因型，一种是10 bp缺失突变;另一种是22 bp缺失突变，同时伴有3 bp插入突变。两种基因型突变均发生在 miRNA-29b1序列成熟区(图3)。

图2 sgRNA及Cas9 PCR产物A:sgRNA PCR产物 B:Cas9 PCR产物Fig.2 PCR product of the sgRNA and Cas9

图3 miRNA-29b1敲除小鼠基因型Fig.3 Genotype of the miRNA-29b1knockout mice

2.3 miRNA-29b1在敲除小鼠体内表达

取F2代纯合子小鼠的心、肝、脾、肺、肾等组织，匀浆后提取细胞总 RNA，反转录后以 real-time PCR进行分别检测miRNA-29b1在上述脏器中的表达。结果如图4所示，与野生型 C57BL/6小鼠相比，miRNA-29b1在F2代纯合子小鼠心、肝、脾、肺、肾等组织中的表达明显下降，表明成功构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。

3 讨论

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。在这一系统中，crRNA通过碱基配对与tracrRNA结合形成双链 RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点切断双链DNA［7］。在基因组编辑过程中，tracrRNA和 crRNA可以融合成为1条具有靶向作用的RNA(sgRNA)表达，该 sgRNA同样可以起到靶向剪切的作用。CRISPR/Cas9的优点是操作简单，对基因组的效率高，需要对某一个靶位点编辑的时候，只需要表达相应的sgRNA即可，不需要对Cas9核酸酶进行改造，它可对任何物种的基因组进行高效率的定向编辑［8］。本研究中我们体外合成一条 sgRNA，该sgRNA具有良好的靶向作用，可引导Cas9蛋白发挥核酸酶作用，在特定的PAM区上游对miRNA-29b1进行定向编辑。sgRNA和Cas9转录产物注射供体小鼠受精卵细胞后，共得到33只F0代小鼠，测序结果表明9只小鼠miRNA-29b1基因发生缺失突变，阳性率为27%，明显高于ES细胞打靶技术，由此证明CRISPR/Cas9技术是一个简单、高效的基因编辑工具，可用于基因修饰动物研究。

miRNA-29家族中各个成员序列高度同源，仅有2～3个主要位点有所不同。miRNA-29a和miRNA-29c均含有22个核苷酸，二者之间仅5’端的第10个核苷酸不同;miRNA-29b含有23个核苷酸，与miRNA-29a/c不同的是，miRNA-29b的3’端具有AGUGUU序列，该序列具有核定位作用，因此miRNA-29b主要位于细胞核［9］。miRNA-29序列的特殊性决定各个成员具有不同的生物学功能，miRNA-29a/b1与某些疾病的发生有关，而miRNA-29b2/c与免疫反应和调节相关。CCl4肝纤维化小鼠模型miRNAs表达谱结果显示有31种miRNAs表达发生变化，miRNA-29家族表达减少，其中miRNA-29b下降最为显著，而在正常肝组织中 miRNA-29b高表达，提示 miRNA-29b可能与肝纤维化疾病有关［10］。miRNA-29b1在多种器官纤维化的调控中发挥着重要作用，研究表明 TGF-β1可下调 miRNA-29b1表达，减轻其对 TGF-β1/Smad信号通路的抑制作用，最终导致纤维化的发生［11］。这提示我们如果敲除miRNA-29b1基因后，纤维化发生时间会提前，纤维化发生程度可能会加重，因此通过敲除miRNA-29b1基因复制酒精性肝纤维化动物模型可克服以往动物模型的缺点。本研究构建的miRNA-29b1基因敲除小鼠，将为酒精性肝纤维化提供良好的动物模型，尤其对研究miRNA-29b1在酒精性肝纤维化发病机制提供良好的研究条件。

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Construction of miRNA-29b1 knockout mice based on CRISPR/Cas9 technology

ZHAO Yong1，SHI Chang-hong1，ZHAO Ya1，XIN Zhi-qian1，LIU Pei-juan1，ZHANG Cai-qin1，BAI Bing1，BAI Jie-ying2，WANG Hua3，ZHANG Hai1
(1.Laboratory Animal Center，The Fourth Military Medical University，Xi’an 710032，China; 2.Laboratory Animal Center，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071; 3.Department of Oncology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022)

ObjectiveTo construct miRNA-29b1 gene knockout mice based on CRISPR/Cas9 technology.MethodsTo design and synthesize sgRNA according to the miRNA-29b1 sequence in Genbank.sgRNA and Cas9 were transcribed to RNA in vitro，these RNA were then microinjected into zygotes of C57BL/6 mice.After mouse birth，the genome DNA was extracted and sequenced to identify its genotype;meanwhile，real-time PCR was used to assay the expression of miRNA-29b1 in the heart，liver，spleen，lung and kidney of mutated mice.ResultA 20 bp sgRNA targeted on miRNA-29b1 was synthesized and transcribed to RNA with Cas9.After microinjection，miRNA-29b1 gene-mutated mice were obtained.The sequencing results showed that there were two types of genotype for the mutated mice，one was 10 bpdeletion，and another was 23 bp deletion accompanied with a 3 bp insertion.Compared with the wild-type mice，the expression of miRNA-29b1 in the heart，liver，spleen，lung and kidney was reduced significantly.ConclusionsmiRNA-29b1 gene knockout mice are constructed successfully by using CRISPR/Cas9 technology.

CRISPR/Cas9;miRNA-29b1;Gene knockout mice

R-33

A

1671-7856(2016)12-0001-04

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.12.001

2016-05-13

国家自然科学基金优秀青年基金项目(NO.81522009);国家自然科学基金面上项目(NO.8137257，81272385);军队重点项目(NO.BWS14J058)。

赵勇(1984-)，男，硕士研究生，专业:动物模型。E-mail:zhaoyong8@aliyun.com。

张海(1971-)，男，副教授，研究方向:动物模型。E-mail:hzhang@fmmu.edu.cn.王华(1978-)，男，教授，研究方向:肝损伤与修复。E-mail:wanghua@ahmu.edu.cn。