整合REV LTR的自然重组马立克氏病毒GX0101的全基因组序列分析

周忠文，苏 帅*，崔 宁，孙 鹏，孙淑红，崔治中

(1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018；2.山东省农科院，济南 250100)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.10.01

整合REV LTR的自然重组马立克氏病毒GX0101的全基因组序列分析

周忠文1，苏 帅1*，崔 宁2，孙 鹏1，孙淑红1，崔治中1

(1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018；2.山东省农科院，济南 250100)

GX0101是一株整合禽网状内皮组织增生症病毒 (REV) 长末端重复序列 (LTR) 的重组马立克氏病病毒 (MDV)。基于MDV GX0101的细菌人工染色体感染性克隆利用高通量测序技术完成了对其全基因组的序列分析。GX0101全基因组长178101 bp, 其基因组的TRL、UL、IRL、IRS、US和TRS区分别长12758 bp、113572 bp、12741 bp、12700 bp、11695 bp、13134 bp。与Md5不同，GX0101含有一个sorf2基因。同时，GX0101全基因组含有一个REV LTR重组片段，位于其基因组US区的sorf1中，sorf2基因前267 bp碱基处。通过与已发表的近10株MDV的比较, 发现GX0101与英国分离株C12/130的两个不同毒力的感染性克隆pC12/130-10和pC12/130-15同源性最高。GX0101的全基因组序列的比较分析，有助于进一步阐明MDV致病性、传播性相关的基因，也有助于揭示不同地域间MDV的遗传变异和演化关系。

REV LTR；重组MDV；感染性克隆；高通量测序；全基因组

马立克氏病是由马立克氏病毒(Marek's disease virus, MDV)引起的鸡的肿瘤病，可以通过空气、鸡只的相互接触传播[1-2]。MDV属于a疱疹病毒，分为3个血清型，一般认为血清Ⅰ型病毒有致病性，可引起T细胞淋巴瘤以及其他病变。血清Ⅱ型与Ⅲ型病毒没有致病性[3-4]。虽然三个血清型基因组结构相似，都是由线性双股DNA组成，但是基因组成上差别很大，与MD致病性相关的基因至今还不是十分明确[5-7]。

GX0101是在中国广西省分离到一株自然重组进禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendothe￣liosis virus, REV)长末端重复序列(Long terminal repeat, LTR)的重组MDV，属于MDV超强毒，毒力强于MDV强毒国际参考株GA株，弱于MDV超强毒国际参考株Md5株，但是横向传播能力强于Md5株[8-10]。利用细菌人工染色体技术构建GX0101的感性克隆，敲除GX0101基因组的 REV LTR片段，证实REV LTR片段的插入显著提高GX0101的横向传播能力[11-12]。敲除GX0101的致肿瘤基因meq后，GX0101Δmeq完全丧失致病性，并且能够提供比MDV商品化疫苗CVI988/Rispens更好的保护效果[13-14]。与缺失meq基因的重组MDV rMd5Δmeq不同，GX0101Δmeq丧失免疫抑制并且在鸡体内能够稳定的复制。RM1是由MDV与REV在细胞上共培养产生的含有REV LTR片段的重组MDV，其毒力已被致弱，对鸡没有致肿瘤性，而GX0101属于超强毒，具有较高的致肿瘤率[15-16]。为了进一步分析引起MDV生物学活性差异相关的基因，本文利用高通量测序技术完成了对MDV GX0101的细菌人工染色体感染性克隆全基因组的序列分析。

1 材料与方法

1.1 细胞及病毒来源 9～10日龄SPF鸡胚购自济南斯帕法斯家禽有限公司，实验室常规方法制备成鸡胚层纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts, CEF)。MDV GX0101由本实验室在中国广西省分离[8]，GX0101感染性克隆GX0101-BAC由本实验室制备并保存[11]。

1.2 主要试剂 高保真Taq酶(包括PCR反应所需buffer)、dNTP、常用限制性内切酶、pMD18-T连接试剂盒等购自宝生物工程(大连)有限公司；凝胶回收试剂盒(D2500-01)、质粒提取试剂盒(D6943-01)均购自美国OMEGA公司；Trans2K DNA Marker、Trans15K DNA Marker购于北京全式金生物技术有限公司。MDV BAC质粒大量提取试剂盒(Plasmid Maxi Kit)购自德国QIAGEN公司。

1.3 GX0101感染性克隆GX0101-BAC质粒的制备

按照QIAGEN Plasmid maxi kit (Cat. No.12163) 操作说明大量制备含有GX0101全基因组的感染性克隆GX0101-BAC质粒，操作保证质粒DNA的完整性。

1.4 GX0101感染性克隆GX0101-BAC的测序 将40.0 μg的GX0101-BAC(200 ng/μL)由基于焦磷酸测序原理的Genome Sequencer 20 FLX System (454 Life Science Corporation)平台进行商业化测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。具体试验流程如下：首先通过高压氮气将基因组雾化成约300～800 bp的片段，然后利用T4 DNA聚合酶和T4核苷酸激酶在DNA片断的5'端加上磷酸基团，3'端变成平端，分别和长44个碱基衔接子(adaptor)进行平端连接。将分离到的含有衔接子的DNA片段与磁珠结合，每一个磁珠都被油水混合的小滴包被，因此可以独立的进行一个片段的扩增，而没有其他片段扩增的影响。经过这种平行扩增后，每个磁珠都有成千上万个相同的基因拷贝。将磁珠富集后加入40×75 mm PicoTiter Plate 板进行测序。

对于重复序列以及其他不确定序列的验证均由多次单独的PCR克隆测序验证。PCR以亲本病毒GX0101感染的CEF细胞DNA为模板，PCR产物均连接到pMD18-T(大连宝生物工程有限公司)载体由ABI-3730 XL DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA)测序分析。

1.5 GX0101的全基因组序列分析 利用DNASTAR、NCBI上的blastP和PsiBlast、MultAlin、MEGA 3.1等其他工具对GX0101基因组序列进行分析。用于同GX0101进行基因组比对的其他MDV毒株(Md5、814、PC12/130-10、PC12/130-15、CVI988、GA、RB1B)基因组序列均由NCBI获取。

2 结 果

2.1 GX0101的基因组结构以及与其他不同株MDV的系统进化关系 GX0101全基因组的拼接来自Genome Sequencer 20 FLX System 平台的13596个读长(平均每个长378 bp)，最终的测序深度是28倍。GX0101全基因组长178101bp (GeneBank NO. JX844666)，包括构建GX0101感染性克隆缺失的部分US2基因的序列(以亲本病毒GX0101感染的CEF细胞DNA为模板进行PCR扩增测序后补齐)，碱基组成的鸟嘌呤和胞嘧啶(G+C)占44%。整个基因组由长末端重复区(terminal repeat long region，TRL)、长独特区(unique long region, UL)、内部长重复区(internal repeat long region, IRL)、内部短重复区(internal repeat short region, IRS)、短独特区(unique short region, US)和短末端重复区(terminal repeat short region, TRS)组成。其中，长末端重复区长12758 bp，在基因组位于1#～12758#；长独特区长113572 bp，位于12759#～126330#；内部长重复区长12741 bp，位于126331#～139071#；内部短重复区长12700 bp，位于139833#～152532#；短独特区长11695 bp，位于152533#～164227#；短末端重复区长13134 bp，位于164228#～177361#，包括近200个开放阅读框，2个拷贝的132 bp的重复片段。GX0101与其他毒株基因组不同区域的比较见表1 (其中IRL/IRS和TRS区为了比较的方便加入了基因组中的α序列)。系统进化树表明，GX0101与来自英国的超强毒C12/130的两个不同致病性的感染性克隆pC12/130-10和pC12/130-15具有比较近的进化关系。584Ap80是将特超强毒584A在细胞传80代，通过动物实验明确证实毒力致弱的病毒，与GX0101也有比较近的进化关系(图1)。

In order to define and characterize the repeat regions in the GX0101 genome, the sequences and copy numbers of the 132 bp repeats in each long repeat (TRL and IRL) and the a-like sequences at the IRL/IRS and TRS/TRL junctions needed to be determined. m: mild; v: virulent; vv: very virulent; vv+: very virulent plus. a: Sequences of BAC constructs. b: Length includes 616 bp of the US2 gene missing in the BAC construct. c: Length includes 813 bp of the US2 gene missing in the BAC construct. d: Calculated length includes 1207 bp of the gD gene missing in the BAC construct. e: Md11 BAC construct contains a large deletion in the TRS region. This number represents an estimation of the length. f: The a-like sequence was not determined for the sequence in GenBank.

2.2 GX0101的基因组中的REV LTR重组片段 通过全基因组测序，证实GX0101全基因组中仅含有一个长538 bp的REV LTR片段，位于基因组短独特区sorf2基因上游267 bp的sorf1基因中(图2)。REV LTR整合片段位于GX0101基因组的152721#～153258#碱基位点(相当于Md5的153175#～153176#)。与细胞培养过程中REV与MDV共感染产生的重组MDV RM1不同，RM1中的REV LTR片段位于其基因组IRS区，在其基因组中sorf1上游832 bp处，sorf2基因上游1163 bp处(相当于GX0101基因组的151736#～151737#)。RM1随着在细胞上传代，在其基因组的TRS区插入另一相同的REV LTR片段。相比，GX0101整合的REV-LTR具有良好的稳定性，经过在细胞、鸡体内多次传代依然保持唯一性。

2.3 GX0101与其他MDV毒株相比基因组中的缺失片段 pC12/130-10与pC12/130-15是来自MDV超强毒C12/130的两个感染性克隆，通过两个感染性克隆的全基因组比较，发现pC12/130-10的71.4～72.2开放阅读框有一增加的494 bp的碱基，其他I型MDV毒株无论疫苗株还是致病株都没有这一片段。GX0101作为超强毒其基因组也没有这一494 bp的片段(图3)，但是在这一71.4～72.2开放阅读框间的序列与pC12/130-15存在100%的同源性，其他均没有如此高的同源性。

GX0101基因组的US区(相对于Md5的164032#～164519#处)与 Md5、Md11、RB1B、CU2、584A、CVI988/Rispens毒株相比缺少486 bp碱基(图4)，但是与GA、814、pC12/130-10、pC12/130-15等毒株一样，并且通过同源性比较发现这一缺失区两端序列与pC12/130-10、pC12/130-15具有100%同源性。虽然这一缺失与病毒致病性的相关性还不明确，但是可以推测这种独特的基因组结构使得sorf1基因完全位于基因组的US区。自然重组的REV-LTR之所以能够稳定的插入这一位点，而并没有随着病毒复制产生另一REV LTR片段，依然保持良好的稳定性，与这一独特结构密切相关。

GX0101 US区与TRS区连接处与GA、814、pC12/130-10、pC12/130-15等毒株一样，与Md5相比缺少830 bp碱基(图5)，但是GX0101、pC12/130-10属于超强毒，GA属于强毒，pC12/130-15属于弱毒，而814株属于疫苗毒，因此这种碱基的缺失与病毒致病性以及稳定性间的关系将是进一步研究的重点。尽管RB1B、CU2、584A、CVI988/Rispens毒株与Md5相比也有碱基的缺失，但是可以看出这五株MDV的缺失显然与GX0101、GA、814等五株不同。

2.4 GX0101与其他MDV毒株相比基因组中的增加片段 GX0101基因组中TRS区的MDV97.3～97.6开放阅读框中，有5个连续的217 bp碱基的重复，其他不同毒株虽然也含有不同拷贝数的重复，但是没有GX0101数目多。同样在GX0101基因组的IRS区的86.2～86.4开放阅读框中，存在3个相同的217 bp的重复序列，其他MDV相比仅含有1～2拷贝的重复。

3 讨 论

自2000年Lee等发表GA株I型MDV(MDV1)全基因组序列以来，已有10多株I型MDV完成了全基因组的序列比较、分析，它们分别属于弱毒疫苗株、强毒、超强毒和特超强毒等不同的致病型[17-19]。GX0101作为自然重组MDV，其致病性、横向传播性以及相关基因片段的功能已经进行了大量的研究[20-22]。为了进一步分析GX0101基因组结构，我们在GX0101的感染性克隆质粒的基础上，利用高通量测序的方法完成了对其全基因组的测序分析(GeneBank NO. JX844666)，GX0101基因组全长178101 bp，其基因组的TRL区、UL区、IRL区、IRS区、US区和TRS区分别长12758 bp、113572 bp、12741 bp、12700 bp、11695 bp、13134 bp。基因组含有两个拷贝的132 bp重复片段。

GX0101基因组中含有唯一的REV LTR插入片段位于US区sorf2基因上游267 bp的sorf1基因中。另一细胞培养上MDV与REV共感染产生的重组毒RM1中的REV LTR片段位于其基因组的IRS区，在其基因组中sorf1上游832 bp处，sorf2基因上游1163 bp处，并且随着病毒的复制在其基因组的TRS区出现另外一REV LTR片段[15]。如果将RM1中的REV LTR片断插入rMd5基因组中相似的位置，拯救的重组病毒在细胞培养上能够稳定遗传但在鸡体内不能稳定存在，在传代过程中容易失去插入的REV LTR片段[23-24]。相反，GX0101在鸡体内即使经过20代传代其基因组中的REV LTR片段依然能够稳定存在。即使将ALV的LTR插入GX0101相同的位置，ALV LTR依然能够在病毒的基因组中稳定存在，随着病毒在鸡体内的复制而复制[25]。从病毒基因组复制的角度思考，由于GX0101独特的基因组结构，sorf1基因位于其短独特区，使得REV LTR整合进sorf1基因后能够稳定存在，重组MDV GX0101具有较强的稳定性。最终由于REV LTR重组片段的影响提高病毒的横向传播能力，使其具有一定的流行优势，在鸡群中被分离出来。

GX0101株MDV与其他10株MDV的全基因组序列比较显示出一个有趣的现象，即从中国分离到的GX0101与英国分离株C12/130株的两个独立的BAC克隆pC12/130-10 和pC12/130-15病毒序列的同源性最高[26-27]。除了GX0101具有这一特有的REV LTR插入片段外，在经比较的190个ORFs (Open reading frames)中不同毒株间发生不同程度变异的有77个。在这77个ORFs中，GX0101与这两个克隆呈100%同源的ORF分别有50个和47个，而与RB1B、Md5、GA、814和CVI988等毒株却只有7～27个ORFs呈现100%同源性。pC12/130-10、pC12/130-15虽然是来自C12/130的两个感染性克隆，但是致病性却截然不同，pC12/130-10属于超强毒，而pC12/130-15属于弱毒。通过两个感染性克隆的全基因组比较，发现pC12/130-10的71.4～72.2开放阅读框有一增加的494 bp的基因片段，而GX0101等其他不同致病性MDV基因组没有，为了继续分析这一片段在MDV致病性的作用，我们将进一步利用同源重组技术将其插入GX0101相似位置，分析重组病毒的复制能力、致病性等生物学活性。因此，对超强毒GX0101及pC12/130-10、pC12/130-15序列差异的比较为进一步分析病毒的基因功能奠定基础。

除此之外，在GX0101基因组TRS区的97.3～97.6开放阅读框中有5个连续的217 bp重复片段，在IRS区的86.2～86.4开放阅读框有3个重复的217 bp的重复片段，其余MDV无论在TRS区还是IRS区均没有如此多的连续重复。虽然这段序列编码的还只是其功能不清的一个“hypothetical protein”，但作为带有最多拷贝数的毒株，进一步分析该重复性片段与GX0101生物学特性间的关系的是有意义的。GX0101 US区与TRS区连接处与GA、814、pC12/130-10、pC12/130-15等毒株一样，与Md5相比缺少830 bp，但GX0101、pC12/130-10属于超强毒，GA属于强毒，pC12/130-15属于弱毒，而814株属于疫苗毒，因此这种碱基的缺失与病毒致病性以及稳定性间的关系将是进一步研究的重点。

鉴于GX0101在致病性、横向传播性及基因组结构上的特性，对GX0101的全基因组序列的比较分析，既有助于阐明与MDV致病性、传播性相关的基因，也有助于揭示不同地域间MDV的遗传变异和演化关系。

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GenomicSequenceAnalysisofaFieldMarek'sDiseaseVirusStrainGX0101withaReticuloendotheliosisVirusTerminalRepeatLongInsert

ZHOU Zhong-wen1, SU Shuai1*, CUI Ning2, SUN Peng1, SUN Shu-hong1, CUI Zhi-zhong1

(1.AnimalScienceandTechnologyCollege,ShandongAgriculturalUniversity,Tai'an,Shandong271018,China; 2.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinary,ShandongAcademyofAgriculturalSciences,Jinan250100,China)

SUShuai,E-mail:ssu6307@163.com

GX0101 is a recombinant Marek's disease virus (MDV) field strain with one reticuloendotheliosis virus (REV) long terminal repeat (LTR) insert. Based on the purified plasmid DNA of GX0101 bacterial artificial chromosome (BAC) infectious clone, the complete genome of GX0101 was sequenced and analyzed using high throughput sequencing technology. The complete genome sequence of GX0101 is 178101 bp in length. The terminal repeat long (TRL), unique long (UL), internal repeat long (IRL), internal repeat short (IRS), unique short (US), and terminal repeat short (TRS) regions were 12758 bp, 113572 bp, 12741 bp, 12700 bp, 11695 bp and 13134 bp, respectively. The GX0101 genome contains only one sorf2 gene, which is different from Md5. GX0101 contains a REV LTR insert located in sorf1 gene of US region, at a site 267 bp upstream of the sorf2 gene in the genome. Among the 10 recently reported MDV strains, whole genome of GX0101 shows the highest identity to two BAC clones PC12130-10 and PC12130-15 of United Kingdom strain C12130 with different virulence. Analysis of the complete sequence of GX0101 will be useful on both studies of gene functions related to pathogenicity or transmission ability, and evolutionary relationships of MDVs in different geographical areas.

REV LTR; recombinant MDV; infectious clone; high throughput sequencing; complete genome

2017-06-29

A

1002-1280 (2017) 10-0001-10

S852.6

国家自然科学基金青年科学基金项目(31402235)

周忠文，硕士，从事分子病毒学研究。

苏 帅。E-mail: ssu6307@163.com

(编辑：李文平)