以CD13为靶点的肝癌细胞耐药性相关机制的研究进展

郭切，徐文，李晓，孙加琳，隋忠国，荆凡波（青岛大学附属医院药学部，山东青岛266003）

以CD13为靶点的肝癌细胞耐药性相关机制的研究进展

郭切＊，徐文，李晓，孙加琳，隋忠国#a，荆凡波#b（青岛大学附属医院药学部，山东青岛266003）

目的：了解以CD13为靶点的肝癌细胞耐药性相关机制的研究进展。方法：查阅近年来国内外相关文献，就CD13参与形成肝癌细胞耐药性的相关机制的研究进行归纳和总结。结果：CD13通过激活肝癌干细胞的自我更新能力、活化Hedgehog信号通路并促进耐药相关蛋白ABCG2的表达、诱导肝癌干细胞对化疗药物产生耐药性；CD13通过上调肝癌细胞中耐药相关蛋白的表达，触发药物外排，促进肝癌细胞耐药性的发生；CD13还通过削弱肿瘤细胞的氧化应激反应，抑制肝癌细胞凋亡，引发肝癌细胞对化疗药物的耐药性。结论：CD13是参与肝癌细胞耐药性形成的驱动因子，有望成为逆转肝癌细胞耐药性和肝癌临床治疗的关键靶标。

氨基肽酶N；肝癌细胞；化疗药物；耐药性

肝癌是我国居民病死率仅次于胃癌、食道癌的第三大恶性肿瘤，其起病隐匿，进展迅速，治疗效果和预后较差[1]。手术切除是治疗原发性肝癌最有效的方法，也是临床应用最广泛的根治性措施，但早期肝癌手术切除预后较好，而中晚期肝癌，特别是巨大肝癌或多发癌灶的根治性切除率较低，预后较差[2]。对于进展期肝癌患者而言，化疗是必要的治疗方法。然而，随着肝癌患者对化疗药物敏感性的逐渐降低，耐药性逐渐增强，使肝癌细胞对多种化疗药物产生明显的耐药性。目前，参与肝癌细胞耐药发生的机制尚未完全阐明，研究肝癌细胞耐药性产生的原因并以此为基础寻找逆转肝癌细胞多药耐药性的关键分子，已成为近年来该领域研究的热门课题。当前研究表明，肿瘤相关抗原分化丛CD13显示为氨基肽酶N（Aminopeptidase），其通过多种机制参与形成肝癌细胞耐药性。鉴于此，笔者查阅近年来国内外相关文献，就CD13参与形成肝癌细胞耐药性的相关机制的研究进行归纳和总结，以期为阐明肝癌细胞耐药性的相关机制，并发现逆转肝癌细胞耐药性的重要靶标提供研究思路。

1 以CD13为靶点的抗肿瘤研究

CD13是一种广泛表达的具有催化活性并依赖于Zn2+的Ⅱ型膜结合金属蛋白酶，属于金属外肽酶M1家族的一员。CD13具有多种生物学功能：（1）CD13表达于内皮细胞、单核细胞等多种细胞表面，参与多肽链的酶催化裂解，并作为信号分子调节多种细胞内信号转导过程，包括细胞迁移、病毒摄取和成血管化等[3]；（2）CD13存在于多种肿瘤细胞（如乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌细胞）的表面，均呈高水平表达，并通过水解蛋白酶降解细胞外基质，促进肿瘤的浸润和转移[4-5]；（3）CD13通过在血管内皮细胞和亚内皮细胞中的特异性高表达，促进肿瘤组织新生血管的形成，还可通过降解胸腺肽和白细胞介素，促进肿瘤细胞的恶化和转移，并通过加速肝癌细胞周期促进肝癌细胞增殖[6-7]。

由此，学者们认为CD13作为重要的肿瘤相关抗原，可成为肿瘤治疗的重要靶点。Cui SX等[8]的研究显示，CD13抑制剂环酰亚胺类肽化合物CIP-13F可诱导Es-2细胞凋亡。Taurin S等[9]的研究显示，具有CD13抑制作用的姜黄素可通过阻碍肿瘤新生血管形成，抑制乳腺癌移植瘤的生长。Dondossola E等[10]的研究发现，小鼠的黑色素瘤细胞系B16F10高表达CD13分子，如果采用短发卡RNA（shRNA）特异性沉默CD13的表达，能显著抑制B16F10细胞的生长和转移。作为目前唯一应用于临床的CD13抑制剂乌苯美司，其能抑制肿瘤细胞表面亮氨酸氨基肽酶和氨肽酶N的作用，诱导肿瘤细胞凋亡并促进宿主的免疫功能，因而被广泛应用于髓性白血病的辅助治疗，学者们还提出通过将乌苯美司及其他CD13抑制剂进行剂型改造、结构修饰或与化疗药物形成复方制剂用于肝癌的治疗[11]。不仅如此，近年来的研究还发现，CD13通过多种机制参与诱导肝癌细胞对化疗药物产生耐药性。

2 以CD13为靶点的肝癌细胞耐药性研究

2.1 以肝癌干细胞为基础的耐药性研究

传统方法不能治愈恶性肿瘤是因为无法阻止肿瘤的复发和转移，其重要原因是肿瘤干细胞（CSCs）的存在。根据CSCs理论，CSCs由普通干细胞或祖细胞的基因突变或表型突变分化而成，通过自我更新构成肿瘤的不同恶性程度，具有自我更新、多分化和高增殖的潜能[12]。近年来，越来越多的研究结果证明肝癌干细胞（LCSCs）的存在，其来源于肝干细胞、卵圆细胞的分化和普通肝细胞的逆分化[13]。乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染使肝干细胞和卵圆细胞发生突变，后者因为对自我更新的调节能力变弱而成为LCSCs，LCSCs自我更新并与其分化形成的肝癌细胞共同形成肝癌[14]。

多种细胞表面标记物已经被用于分离和鉴定LCSCs，包括CD13、CD24、CD44、CD90、CD133和上皮细胞黏附分子（EpCAM）[15]。有课题组采用明胶海绵微粒经导管肝动脉化疗栓塞术（TACE）与CD13抑制剂联合治疗原发性中晚期肝癌，结果发现联合治疗组与TACE单独治疗组相比，具有更加明显的治疗有效率和稳定率，但通过分析TACE治疗后的复发性肝癌病例发现，CD13+LCSCs在肝组织纤维囊形成的低氧微环境中仍保持半休眠的G0/G1期状态，能够对抗化疗引起的细胞内氧自由基增加[16]。Nagano H等[17]的研究联合5-氟尿嘧啶（5-FU）和CD13抑制剂作用于肝癌移植瘤模型小鼠，结果显示联合用药组的肿瘤体积比单独使用5-FU或CD13抑制剂的治疗组小；进一步的实验发现，单用5-FU后，移植瘤中CD13+LCSCs的比例明显增加，且该群细胞对5-FU和顺铂均表现出较高的耐药指数，将该群细胞移植至免疫缺陷小鼠皮下，3周后会生长出新的肿瘤，说明该群细胞能够自我更新；若同时给予CD13阻断抗体，则未见新生肿瘤长出，且CD13+LCSCs对5-FU的敏感性明显增强，可见阻断CD13的功能可以逆转CD13+LCSCs对化疗药物的耐药性，从而抑制肿瘤的生长和复发。由此可见，CD13可以作为半休眠期LCSCs的功能性生物标记物，参与维持LCSCs自我更新和肿瘤起始能力，并诱导LCSCs对化疗药物的作用产生抵抗。

进一步研究表明，CD13诱导LCSCs对化疗药物产生耐药性，其机制还与Hedgehog（Hh）信号通路的异常激活有关[18]。Hh信号通路对促进哺乳动物发育和维持干细胞功能有重要作用，其在正常组织细胞中多处于关闭状态。Hh信号通路受靶细胞膜上Patched（Ptc）和Smoothened（Smo）2种受体控制，信号传导始于Ptc，相继通过G蛋白藕联受体和Smo，引起下游Gli家族锌指蛋白和其他靶基因的活化，而人三磷酸腺苷（ATP）结合盒转运超家族成员ABCG2被证实是Hh-Gli通路的直接靶分子，其通过ATP依赖的方式促进药物外排，与多种肿瘤细胞耐药性的产生有直接关系。最近有报道指出，Gli-1基因在肝癌细胞和组织中存在明显的高表达[19]。通过绿色荧光蛋白定位实验发现，CD13和Ptc以蛋白融合物的形式定位于肝癌细胞表面，由此说明CD13在LCSCs中作为一种伪配体与Ptc结合，从而打开Hh信号通路，引起Gli家族活化，促进耐药相关分子ABCG2的表达[19-20]。

2.2 以耐药相关蛋白为基础的耐药性研究

近年来研究表明，CD13对肝癌耐药细胞表达高水平的耐药相关基因和大量的跨膜转运蛋白具有重要的调节作用[21]。功能性多药耐药基因1（MDR1）具有原癌基因特征并广泛存在于人类细胞组织中，由其编码的P糖蛋白（P-gp）能够与化疗药物结合，利用ATP解能将药物泵出细胞外，使其不能达到有效治疗浓度，从而诱导肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性。而CD13能够明显上调MDR1的基因表达，并提高P-gp的蛋白水平，这也被证实是肝癌细胞耐药性产生的主要原因[21]。此外，学者们发现，在肝癌细胞的MDR1基因上游存在原癌基因P53和基因系尾型同源盒基因2（CDX-2）对其转录和翻译进行调控[22]。MDR1编码的P-gp是一种磷酸化蛋白，需要自身磷酸化才能发挥活性，蛋白激酶C（PKC）是一种以多种酶为底物的Ca2+依赖型同工酶，研究发现在肝癌细胞系HepaG2中，CD13能诱导PKC的表达，被认为可引起P-gp的高度磷酸化[23]。此外，在结肠癌和肝癌等多种肿瘤细胞中，CD13表达可以诱导环氧合酶2（COX-2）的明显表达，而后者的异常高表达与磷酸化P-gp的表达呈正相关[23]。

多药耐药相关蛋白（MRPs）的表达是肿瘤细胞对化疗药物产生耐药的另一个重要因素。MRPs与P-gp同属于ABC转运蛋白超家族，但不同的是MRPs介导的药物转运与依赖ATP的谷胱甘肽-S结合载体有关，并借助于谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）的活性将药物泵出细胞外，使化疗药物发挥不了杀伤肿瘤细胞的作用，或作用明显减弱[24]。目前，已经克隆的MRPs包括MRP1、MRP2等9个成员，MRP2早先被认为主要在人肝细胞基底膜上表达，其功能是抑制炎症因子的释放从而保护肝细胞，此外还参与胆红素的排泄。通过比较MRP2、MRP3、MRP5在正常肝细胞系L-02、肝癌细胞系BEL及肝癌耐药细胞系BEL/ADM中的表达发现，MRP2基因在BEL/ADM细胞中的表达明显高于L-02、BEL细胞，而在L-02、BEL细胞中的表达差异并无统计学意义；MRP3、MRP5的基因表达在3种细胞中均存在显著的差异[25]。上述结果提示，MRP2可能参与了肝癌细胞内在性耐药的形成，而MRP3、MRP5可能与肝癌细胞的获得性耐药有关；在原发性肝癌组织和癌旁组织中，存在MRP2表达的差异，该差异与CD13的表达呈正相关[26]。

2.3 以活性氧为基础的耐药性研究

化疗药物多依靠诱导肿瘤细胞凋亡来发挥治疗效果，而细胞凋亡的死亡受体途径和线粒体途径在很大程度上都依赖于活性氧（ROS），ROS可引发Ca2+内流而促进细胞色素C（CytC）的释放，CytC与凋亡酶激活因子（APAF-1）结合形成凋亡体，后者通过进一步活化caspase-9（cysteinyl aspartate specific proteinase 9）等凋亡级联分子，引起细胞凋亡[27]。研究表明，在肝癌细胞中，CD13的表达持续增高，同时伴随着ROS水平的降低；而在长期应用5-FU的肝癌患者组织中，APAF-1的表达明显低于初期化疗患者，这种差异与CD13的表达存在负相关[28]。本课题组也发现，在肝癌组织与正常组织中，BCL-2家族中的凋亡抑制蛋白Bad、BCL-XL的表达存在差异，这种差异与CD13的表达呈正相关[29]。

促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）链是生物信号传递网络中的重要途径。MAPK可以通过其3个亚分子MAPK、MAPK激酶和有丝分裂原活化蛋白（MEK）激酶将信号传递给下游的级联分子ERK1/2（Extracellular signal-regulated kinase1/2）、JNK（c-Jun N-terminal kinase）和p38 MAPK，其中ERK1/2信号转导通路调控细胞增殖和分化，JNK和p38 MAPK信号通路在炎症与细胞凋亡等应激反应中发挥重要作用[30]。近年来研究发现，ROS除了能直接诱导细胞凋亡，还与其下游信号分子MAPK一同对肿瘤细胞的耐药性承担着调节作用。Kim KK等[31]的研究用钼酸盐联合5-FU、丝裂霉素C作用于肝癌耐药细胞株BEL/ADM时发现，细胞内ROS的水平升高，同时JNK和P38 MAPK被激活，细胞发生凋亡；进一步的研究发现COX-2的表达降低。Bekhite MM等[32]的研究用丁硫氨酸-亚砜亚胺处理耐药肝癌细胞株HCC-LM3细胞，发现前者诱导释放的ROS能抑制关键酶GSTs的活性，从而降低细胞内谷胱甘肽的合成；此外，在HCC-LM3细胞中，P-gp的表达下调，同时伴随着ERK1/2和JNK的活化。由此可见，ROS可作为第二信使参与MAPK的信号途径，通过下调MRPs的表达进而抑制肝癌细胞对化疗药物的耐药性。上述结果表明，CD13的大量表达犹如一个阀门，它的开启使ROS诱导的氧化应激受阻，肝癌细胞的凋亡被抑制，MAPK信号通路的活化受阻，P-gp的表达上调，从而导致了肝癌细胞耐药性的产生。

3 结语

肝癌作为严重威胁人类健康的恶性疾病，近年来的发病率、复发率和病死率均呈逐年增高的趋势，传统化疗药物虽然仍应用于肝癌的治疗，但如何改善肝癌细胞对其产生的耐药性已经成为棘手的问题。CD13作为肿瘤相关抗原已被证明与肿瘤血管生成、迁移和侵袭有关，还可通过诱导肝癌干细胞对化疗药物产生抵抗、上调耐药相关蛋白表达、降低ROS诱导的氧化应激反应并抑制肝癌细胞凋亡，诱导肝癌细胞耐药性的产生。据此，CD13是参与肝癌细胞耐药性形成的驱动因子，有望成为逆转肝癌细胞耐药性和肝癌临床治疗的关键靶标。在此基础上通过将乌苯美司及其他CD13抑制剂进行剂型改造、结构修饰或与化疗药物形成复方制剂，有望产生逆转肝癌细胞耐药性并提高肝癌化疗敏感性的新药，为肝癌的临床药物治疗提供更宽阔的研究前景。

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R735.7；R730.5

A

1001-0408（2017）32-4592-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.32.34

＊主管药师，硕士。研究方向：临床药理。电话：0532-82912263。E-mail：guoqie822@163.com

#a通信作者：主任药师，硕士。研究方向：药物合理应用。电话：0532-82911277。E-mail：470367762@qq.com

#b通信作者：主任药师，硕士。研究方向：疼痛药物与抗肿瘤药物的合理应用。电话：0532-82911033。E-mail：Jingbf178@sina.com

2017-01-01

2017-07-04）（编辑：陶婷婷）