SPE/GC-MS法检测全血中的杜冷丁

张科军

(广东华生司法鉴定中心，广东 广州 510610)



SPE/GC-MS法检测全血中的杜冷丁

张科军

(广东华生司法鉴定中心，广东 广州 510610)

建立SPE/GC-MS方法测定全血中杜冷丁的含量。采用MCX 3 mL(60 mg)固相萃取小柱萃取血中杜冷丁，用气相色谱质谱联用仪检测，结合保留时间和特征离子及数据库进行定性和定量分析。杜冷丁在1～20 μg/mL范围内线性良好，仪器方法的检出限为0.01 μg/mL(S/N≥3)，平均萃取回收率为83.81%，精密度为3.8%，前处理pH值在2～9范围内都能取得良好的萃取效果，C18和HLB固相萃取小柱的对杜冷丁萃取回收率均能达到80%。固相萃取方法适用于全血中杜冷丁的定性定量分析。

杜冷丁；固相萃取；气相色谱质谱；全血

杜冷丁又名哌替啶，化学名是1-甲基-4-苯基-4-哌啶甲酸乙酯，是一种临床应用的人工合成麻醉镇痛药，杜冷丁的药理作用与吗啡相似，同为阿片受体激动剂，效力约为吗啡的1/10～1/8，长期使用会产生依耐性，其依赖性程度介于吗啡和可待因之间，属违禁药品[1-2]。

人血中杜冷丁的萃取可用有机溶剂乙酸乙酯[1]、环己烷[3]和乙醚[4-5]，杜冷丁的检测可采用GC-NPD、GC-MS和LC-MSMS[1,3-5]。但未见固相萃取血液中杜冷丁方法，固相萃取技术已广泛应用于医药、临床血中药物浓度检测、刑事化验等领域的样品前处理，本文选用MCX建立提取血中杜冷丁的方法，MCX为混合型强阳离子交换反相吸附剂，它提供了双重保留模式：离子交换和反相，离子交换通过带电的溶质分子与离子交换柱中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法。目前自动化固相萃取仪也越来越被广泛使用，本文所用的自动萃取仪为吉尔森公司的单通道GX-241。

1 实 验

1.1 主要仪器与试剂

杜冷丁(1 mg/mL)，Cerilliant；甲醇(色谱纯)，超纯水，浓盐酸(分析纯)，pH=6缓冲液(色谱纯)，十六水四硼酸钠(分析纯)，二氯甲烷(分析纯)，异丙醇(分析纯)，氢氧化铵(分析纯)。

GX-241单通道全自动固相萃取仪，美国Gilson公司；GC 2010 plus -QP2010 plus气质联用仪，日本岛津公司。

1.2 样品预处理

取空白人全血2 mL于塑料离心管中，加4 mL pH=6缓冲液混匀，超声振荡20 min，2500 r/min涡旋2 min，10000 r/min离心20 min，取上清液3 mL供萃取。

采用Waters公司MCX 3 mL 60 mg固相萃取小柱，萃取步骤为：①分别用2 mL甲醇，超纯水，pH=6缓冲液以1 mL/min流速淋洗活化柱子；②取上述处理好的液体3 mL以0.5 mL/min流速上样；③分别用3 mL超纯水，3 mL pH=4缓冲液，4 mL甲醇以1 mL/min流速过柱洗脱杂质；④用4 mL洗脱液(二氯甲烷:异丙醇:氨水=8:2:0.2)以0.5 mL/min流速洗脱目标物，用2 mL空气吹萃取柱，收集洗脱液于试管中；⑤洗脱液在40 ℃下用氮气吹干，残渣用100 μL甲醇溶解，取1 μL进样。

1.3 仪器分析条件

色谱柱：30 m×0.25 mm×0.25 μm DB-5 MS，初始温度120 ℃保持1 min，以5 ℃/min升温到130 ℃，再以45 ℃/min升温到210 ℃，最后以15 ℃/min升温到280 ℃保持8 min；进样口温度为280 ℃，氦气流速1 mL/min，接口温度280 ℃；EI源为70 eV 、温度为230 ℃。选择杜冷丁的特征离子为172、274、218，其中定量离子为274。

2 结果与讨论

2.1 固相萃取分析结果

添加1 μg杜冷丁标准品到空白全血中，用上述固相萃取方法和仪器条件进行分析，结合保留时间和质谱图及NIST数据库进行杜冷丁识别，分离效果好、质谱匹配度高，如图1所示。

图1 1 μg杜冷丁血样萃取后的特征离子图和质谱图

应用本文1.2方法对2016年4月佛山交警送检的血液样本进行分析，结果显示送检血液样本中检出杜冷丁成分，含量为20.2 μg/mL，如图2所示。

图2 送检血液样本中杜冷丁检出色谱图和质谱图

2.2 线性范围和检出限

用1 mg/mL杜冷丁标准品配置成1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL五个浓度的标准溶液，按照1.3方法处理，以测得的峰面积Y与相应的标准溶液浓度X进行线性回归，线性方程为y=1288.81x-131.52，相关系数r2=0.9992，如图3所示。杜冷丁在1～20 μg/mL范围内具有良好的线性。

配置0.1 μg/mL杜冷丁标准溶液，按照1.3方法以SIM 247模式进行分析，计算性噪比，以S/N≥3得杜冷丁最低检出限为0.01 μg/mL。

2.3 回收率和精密度

添加杜冷丁空白全血中使浓度为0.5 μg/mL，用外标法计算杜冷丁的回收率(n=3)，同时用相对标准偏差公式计算精密度，测得其回收率高于80%，精密度为3.76%，如表1所示。

表1 不同pH值的回收率和精密度

2.4 用不同pH值缓冲液的萃取效果

添加杜冷丁空白全血中使浓度为0.5 μg/mL，分别用pH=3和pH=9的缓冲液加入到血液中，按照1.2方法萃取，计算杜冷丁的回收率(n=3)及相对标准偏差，如表1所示；在酸性和碱性条件下，回收率效果良好超过90%，说明MCX固相萃取小柱对杜冷丁在酸性和碱性较强的条件下也能有很好的保留效果。

2.5 固相萃取柱比较

分别用HLB、C18固相萃取小柱对0.5 μg/mL杜冷丁加标血液进行萃取分析，waters公司HLB 3 mL 60 mg固相萃取小柱的萃取条件：①分别用4 mL甲醇、超纯水、pH=6缓冲液以2 mL/min流速淋洗活化柱子；②取按照1.2处理好的上清液以0.5 mL/min的流速上样；③分别用3 mL pH=6缓冲液、超纯水以1 mL/min流速过柱洗脱杂质；④用4 mL洗脱液二氯甲烷以0.5 mL/min流速洗脱目标物，用2 mL空气吹萃取柱，收集洗脱液于试管中；⑤洗脱液在40 ℃下用氮气吹干，残渣用100 μL甲醇溶解，取1 μL进样。Agela ODS C183 mL 200 mg固相萃取小柱的萃取条件：

①分别用4 mL甲醇、超纯水以2 mL/min流速淋洗活化柱子；②取按照1.2处理好的上清液以0.5 mL/min的流速上样；③用3 mL超纯水以1 mL/min流速过柱洗脱杂质；④用4 mL洗脱液甲醇以0.5 mL/min流速洗脱目标物，用2 mL空气吹萃取柱，收集洗脱液于试管中；⑤洗脱液在40 ℃下用氮气吹干，残渣用100 μL甲醇溶解，取1 μL进样。计算杜冷丁的回收率(n=3)和相对标准偏差，如表2所示， 杜冷丁的回收率均高于80%，说明HLB和C18固相萃取小柱对杜冷丁都有较好的保留效果。

表2 不同种类SPE小柱的回收率和精密度

3 结 论

本文建立用SPE/GC-MS法对全血中杜冷丁进行萃取和检测，pH值对MCX小柱的萃取效果没有影响，且HLB和C18小柱也对杜冷丁的萃取效果良好，杜冷丁气质检出限为0.01 μg/mL。本实验还用二氯甲烷洗脱C18小柱上的杜冷丁，结果杜冷丁并没有被洗脱下来，所以选用甲醇作为C18小柱的洗脱液。

[1] 彭安林,张俊萍.液相色谱串联质谱法测定人血浆中杜冷丁的含量[J].中国医院药学杂志,2013,33(08):668-669.

[2] 廖林川,王玉瑾,马丽霞,等.法医毒物分析[M].北京:人民卫生出版社,2009:159-160.

[3] 孟品佳,姚丽娟,王景翰,等.生物检材中杜冷丁、美沙酮的萃取与检测[J].中国人民公安大学学报:自然科学版,2004(4):7-9.

[4] 薛月华,沈敏,沈保华,等.全血中杜冷丁的气-质联用法测定及代谢动力学的研究[J].法医学杂志,1996,12(3):139-141.

[5] 黄爱芳,李建波,冯露敏,等.LS-MS法同时检测人血浆中杜冷丁、曲马多和美沙酮[J].中国卫生检验杂志,2010,20(12):3191-9192.

Determination of Dolantin in Whole Blood by SPE/GC-MS

ZHANGKe-jun

(Center for Forensic Science Waston Guangdong, Guangdong Guangzhou 510610, China)

An analytical method based on SPE/GC-MS was established for the quantitation of dolantin in whole blood. Dolantin was extracted from blood with solic phase extraction column MCX 3 mL (60 mg), detected by gas chromatography mass spectrometry, and confirmed by retention time, characteristic ions and NIST database. The extraction was quantified by external standard method. There was good linearity between 1～20 μg/mL. The MDL of dolantin was 0.01 μg/mL(S/N≥3).The recovery of the extraction was about 83.8% and RSD was about 3.8%. When the pH value of buffer solution was between 2～9, the extraction effect was good as well. The effect of C18and HLB SPE columns were above 80%. The method of SPE is applicative to confirm and quantify dolantin in whole blood.

dolantin; SPE; GC-MS; whole blood

张科军(1985-)，男，应用化学专业硕士，法医毒物化学助理。

O657

A

1001-9677(2016)023-0100-03