骨碎补总黄酮对牙周炎大鼠龈沟液骨钙素及牙槽骨骨密度的影响

曾辉 赵许兵 李子夏 周芳 唐成芳△

(1.西安医学院口腔医学系，陕西 西安 710021；2.西安交通大学口腔医学院急特诊科，陕西 西安 710004)



骨碎补总黄酮对牙周炎大鼠龈沟液骨钙素及牙槽骨骨密度的影响

曾辉1赵许兵2李子夏1周芳1唐成芳1△

(1.西安医学院口腔医学系，陕西 西安 710021；2.西安交通大学口腔医学院急特诊科，陕西 西安 710004)

目的 观察骨碎补总黄酮对牙周炎大鼠龈沟液骨钙素(OC)和牙槽骨骨密度的影响,探讨其治疗牙周炎的机制。方法 成功建立SD大鼠牙周炎模型之后,使用完全随机分组方法将大鼠分为正常组、牙周炎组、骨碎补总黄酮组,每组18只。建模4周后分别灌服生理盐水和骨碎补总黄酮240 mg/(kg·d)。各组大鼠分别在建模后第4，6，8周各处死6只。放射免疫分析法测定龈沟液OC水平,显微CT测定大鼠牙槽骨骨密度。结果 牙周炎组龈沟液OC水平显著高于正常组和骨碎补总黄酮组(P<0.05);骨碎补总黄酮组龈沟液OC水平在6周和8周时显著低于牙周炎组(P<0.05),8周时与正常组龈沟液OC水平相比差异无统计学意义 (P>0.05)。牙周炎组牙槽骨骨密度显著低于正常组和骨碎补总黄酮组(P<0.05);骨碎补总黄酮组牙槽骨骨密度在6和8周时显著高于牙周炎组(P<0.05)。结论 骨碎补总黄酮可降低牙周炎大鼠龈沟液骨钙素水平,增加牙槽骨骨密度,对大鼠牙周炎具有一定治疗作用。

牙周炎； 骨钙素； 骨密度； 骨碎补总黄酮

牙周炎已被医学界定论为继癌症和心脑血管疾病之后，威胁人类身体健康的第3号杀手，而牙周炎引起的牙槽骨吸收又是致使人类牙齿松动、脱落的重要原因。骨碎补总黄酮是从中药骨碎补中提取出来的最主要的一种黄酮成分。目前，动物实验已证实骨碎补总黄酮能提高去势大鼠的骨密度[1]，显著降低骨质疏松小鼠血清骨钙素水平[2]。有研究[3-4]显示，特定位点龈沟液骨钙素的水平可以反映局部牙槽骨的变化，可作为牙周炎局部病变代谢变化的标志。本实验在成功建立大鼠牙周炎模型的基础上，灌服骨碎补总黄酮，比较治疗前后大鼠龈沟液骨钙素水平(OC)以及牙槽骨骨密度的变化。探讨骨碎补总黄酮对牙周炎大鼠牙槽骨骨代谢影响的机制，为临床进一步运用其治疗牙周炎提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物 采用清洁级雄性 SD大鼠54只，体质量250 g左右，购于西安交通大学医学院实验动物中心。于标准环境下适应性饲养1周后实验。

1.2 实验试剂 骨碎补总黄酮(四川中药研究所研制，批号961214)，使用时加灭菌水制成一定浓度溶液(0.36 g/L)灌胃，水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)，骨钙素放免药盒(解放军总医院科技开发中心，批号20060728)。

1.3 器械与设备 显微持针器、眼科剪、平镊、灌胃器、4-0号医用编织线(上海浦东金环医疗用品有限公司)，全自动高温高压灭菌锅(HV-50)，显微CT(Inveon，Siemens，Germany)，SN-6105γ放射免疫计数器(上海核所日环光电仪器有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物模型建立 54只雄性SD大鼠标号后，随机选择18只大鼠作为正常组不加干预，正常饲养。余下36只适应性喂养1周后，建立牙周炎模型。10%水合氯醛按0.38 mL/100 g体质量，腹腔注射麻醉。四肢及头部固定于木板上，开口器牵开口角，用4-0号丝线结扎双侧上颌第二磨牙颈部(颊侧打结，并尽量压入龈沟内)，从结扎当天起饲软食、高糖水(葡萄糖100 g/L)，从大鼠上颌第二磨牙结扎丝线日起计算，建模时间共计4周。

1.4.2 实验动物分组 大鼠牙周炎模型建立成功后去除结扎丝线，采用完全随机分组方法将建模成功大鼠分为牙周炎组和骨碎补总黄酮组，与正常组大鼠一致，每组18只。从第5周开始，骨碎补总黄酮组灌胃骨碎补总黄酮240 mg/(kg·d)，正常组、牙周炎组均灌以相同体积的生理盐水。各组分别在建模后第4，6，8周取实验牙龈沟液后处死大鼠，截取双侧上颌骨，行显微CT扫描，每组各时间点处死的动物均为6只。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 龈沟液内骨钙素水平测定 将剪好的3个WhatmanⅠ号滤纸条(4 mm×1 mm)放入1个微离心管中高压灭菌后称重备用。取龈沟液时，将滤纸条分别轻轻插入实验牙的近腭、腭、远腭的牙周袋内，遇阻力停滞30 s后取出。每颗受试牙的龈沟液(GCF) 总量为三者相加之和，按龈沟液密度=1计算体积，称重后的样本放回离心管，-70 ℃保存。测定前将样本和试剂盒中各试剂取出，室温下30 min解冻。每个微离心管管内加入150 μL pH7.4的磷酸盐缓冲液，浸泡并震荡1 h后，12 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清液，用放射免疫分析法测定龈沟液OC水平，具体检测步骤按骨钙素放免药盒使用说明进行。

1.5.2 牙槽骨骨密度测定 显微CT扫描方式360°旋转，电压80 kV，电流80 μA。图片分辨率1024×1024，层距20 μm，曝光时间2 960 ms。采用Micro-View系统对扫描所获影像进行三维重建，CT值高于1 000定义为硬组织。选用三维兴趣区间(3D ROI)工具，将大鼠上颌第二磨牙牙根内侧边缘连接成一个四边形，各线与根分叉区牙槽骨交叉边界线即作为平面定选区域；以平面定选区域为起始，垂直于牙体长轴由根尖区范围向根分叉处平移扫描，每20 μm为一个层面，垂直距离为1 200 μm，待所有层面完成后即形成一个三维兴趣区。对各组大鼠上颌第二磨牙的三维兴趣区进行扫描之后，获取大鼠实验牙牙槽骨的骨密度值。

2 结 果

2.1 龈沟液内骨钙素水平变化 正常组在整个实验期间，骨钙素水平差异无统计学意义(P>0.05)；牙周炎组和骨碎补总黄酮组在建模4周后龈沟液OC水平显著上升(P<0.05)；治疗同时期内，牙周炎组龈沟液OC水平明显高于正常组和骨碎补总黄酮组(P<0.05)；8周时，骨碎补总黄酮组OC水平与正常组相比差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠龈沟液中骨钙素水平

注:与正常组相比，*P<0.05；与牙周炎组相比，#P<0.05。

2.2 牙槽骨骨密度变化 建模4周后大鼠牙槽骨骨密度与正常组相比显著下降(P<0.05)。治疗同时期内，牙周炎组牙槽骨骨密度明显低于正常组和骨碎补总黄酮组(P<0.05)；6周和8周时，骨碎补总黄酮组大鼠牙槽骨骨密度明显高于牙周炎组(P<0.05)，但与正常组大鼠牙槽骨骨密度值尚有一定差别(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠牙槽骨骨密度变化

注:与正常组相比，*P<0.05；与牙周炎组相比，#P<0.05。

3 讨 论

OC属于γ-羧谷氨酸蛋白类，由成骨细胞合成分泌，不受骨吸收因素的影响。其能反映成骨细胞的活性，但更大程度上反映的是骨转换，其水平高低可代表骨形成状态。目前，OC在骨代谢中的生理功能尚不明确，但一般认为其可维持骨的正常矿化速率，抑制生长软骨的矿化速率[5]。W.V.Giannobile等[6]在研究狗实验性牙周炎时发现，龈沟液中骨钙素有可能作为牙周病进展过程中的预测物；K.Nakashima等[7]在临床研究中发现特定位点龈沟液OC水平可以反映局部牙槽骨变化。牙槽骨破坏吸收是牙周炎的主要病理变化之一，而OC作为骨代谢瞬间变化的一项特异的生化指标，可直接反映药物对牙槽骨的骨形成和重建情况的影响。

以往主要通过组织病理学、X线影像学评价牙槽骨改建。但组织病理切片制作较为复杂，且无法定量分析，而X线片的二维性又决定了其在评价牙槽骨改建方面的局限性。而显微CT可对兴趣区内的牙槽骨进行测量，能充分排除牙体组织对测量的影响，牙槽骨的骨密度水平也可良好体现牙槽骨改建情况，以评价药物对牙周炎的治疗作用。

中医学理论认为，“肾主骨生髓”，肾虚导致骨质疏松骨破坏。因此，补肾之法成为治疗骨破坏之主法。骨碎补性苦、温，入肝、肾经。中医主要用来治疗跌打损伤、骨折、肾虚腰痛。骨碎补总黄酮作为中药骨碎补中最主要的一种黄酮成分，体外研究表明其对成骨细胞体外培养的分化和增殖均有促进作用[8]；体内实验证实骨碎补总黄酮可促进骨组织愈合[9]，抑制大鼠炎症关节骨破坏[10]。

本实验以“牙颈部丝线结扎+高糖饮食”的方法建立SD大鼠牙周炎模型，建模后龈沟液OC水平显著升高，牙槽骨骨密度显著下降。其机制可能为：局部机械刺激诱导大鼠牙周组织发生炎症反应而造成牙槽骨吸收，大鼠牙槽骨骨间质细胞外和血清内的OC释放入龈沟液，造成其水平升高。第6周时牙周炎组和骨碎补总黄酮组大鼠龈沟液OC水平、牙槽骨骨密度均显示出上升趋势，但牙周炎组OC水平显著高于骨碎补总黄酮组(P<0.05)、骨密度显著低于骨碎补总黄酮组(P<0.05)。其机制可能为：去除牙周炎刺激因素后，两组大鼠都进入骨改建高峰期，而骨碎补总黄酮组的骨改建速率更快，在第6周时已显示出趋于稳定的趋势。8周时，牙周炎组和骨碎补总黄酮组大鼠龈沟液OC水平都显示出下降趋势，牙槽骨骨密度都显示出上升趋势。但牙周炎组龈沟液OC水平显著高于骨碎补总黄酮组(P<0.05)、骨密度显著低于骨碎补总黄酮组(P<0.05)，且此时骨碎补总黄酮组OC水平已逐渐恢复至正常水平。其机制可能为：第8周时，两组大鼠牙槽骨骨改建都有向平稳发展的趋势，但骨碎补总黄酮组改建速度更快，此时已接近正常水平。而龈沟液OC水平达到正常值的时间短于牙槽骨骨密度恢复正常的时间，也进一步说明了龈沟液中OC可作为牙周病进展过程中的预测物。综上所述，对于牙周炎患者给予骨碎补总黄酮治疗可能会促进牙槽骨重建、增加牙槽骨骨密度、有效减缓牙周炎进程，从而帮助患者早日康复，而利用骨碎补总黄酮治疗牙周炎也值得进一步研究和推广。

[1] 刘剑刚,谢雁鸣,徐哲,等.骨碎补总黄酮的活血化瘀作用及对实验性微循环障碍和骨质疏松的影响[J].中国骨质疏松杂志,2006,12(1):46-49.

[2] 陈勇,肖润梅,杜鹏,等.骨碎补、淫羊藿总黄酮与黄芪醇提物对维甲酸所致小鼠骨质疏松的实验研究[J].湖北大学学报(自然科学版),2007,29(2):189-191,195.

[3] 孙靖临,孟焕新.龈沟液中骨钙素含量与牙周炎的关系[J].中华口腔医学杂志,2002,37(5):394.

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[7] Nakashima K,Rochrich N,Cimasoni G.Osteocalcin,prostaglandin E2 and alkaline phosphatase in gingival crevicular fluid:their relations to periodontal status[J].Journal of Clinical Periodontology,1994,21(05):327-333.

[8] 谢雁鸣,秦林林,邓文龙,等.骨碎补总黄酮对成骨细胞体外培养作用的机制研究[J].中华中医药杂志,2005,20(3):161-162.

[9] 吴静,向学熔.骨碎补总黄酮对体外培养人牙周膜细胞总蛋白、超微结构的影响[J].激光杂志,2012,33(6):81-83.

[10] 张镝,贾志杰,田永利,等.骨碎补总黄酮与柚皮苷干预股骨干骨缺损模型大鼠骨愈合的比较[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(37):6947-6950.

Effect of Rhizoma Drynariae Flavone on the sulcular fluid level of osteocalcin and alveolar bone mineral denisity in periodontitis rats

ZengHui1,ZhaoXubing2,LiZixia1,ZhouFang1,TangChengfang1△.

1.DepartmentofStomatology,XianMedicalCollege,Xian710021,China; 2.DepartmentofEmergency,StomatologyMedicalCollege,XianJiaotongUniversity,Xian710004,China.

Objective To observe the effect of Rhizoma Drynariae Flavone on the sulcular fluid level of osteocalcin (OC) and alveolar bone mineral density during experimental periodontitis for its therapy mechanism. Methods The model of experimental periodontitis was established by means of silk ligatures around and high-carbohydrate diet. Then the animals were randomly assigned to three groups and received daily oral treatment. Four weeks after the ligure, Rhizoma Drynariae Flavone was given to rats of treatment group at a dose of 240mg/kg/d by gastric injuction, and the same amount of saline was given to rats of normal control and periodontitis group for same period. Six animals in each group were randomly selected and sacrigiced at 4, 6 and 8 weeks. OC was detected by radio immunoassay, alveolar bone density was detected by micro-computed tomographic. Results The level of OC in experimental periodontitis group was significantly higher than that in control group and treatment group (P<0.05), and the level of OC in treatment group was significantly lower than that in periodontitis group at week 6 and 8 (P<0.05). There were no statistical significantly differences between control group and treatment group at week 8 (P>0.05). The alveolar bone mineral density in periodontitis group was significantly lower than that in control and treatment group (P<0.05).The level of alveolar bone mineral density in treatment group was significantly higher than that in periodontitis group at weeks 6 and 8 (P<0.05). Conclusion Rhizoma Drynariae Flavone reduces the level of osteocalcin in the sulcular fluid, increases aoveolar bone mineral density. Rhizoma Drynariae Flavone could play an important role in treating periodontitis.

Periodontitis； osteocalcin； Alveolar bone mineral denisity； Rhizoma Drynariae Flavone

西安医学院2015年青年科研基金项目(项目编号：2015QN11)；陕西省科技厅社会发展项目(项目编号：2015SF242S)

R-332,R784.1+2

A

1000-744X(2016)05-0460-03

2014-12-12)

△通信作者， E-mail：tangchengfang@sohu.com