大鼠ILK-RNAi慢病毒表达载体的构建及鉴定

白志勋 陆静 杨亦彬△

(1.遵义医学院附属医院肾病风湿科，贵州 遵义563000；2.遵义医药高等专科学校，贵州 遵义 563000)



·论 著·

大鼠ILK-RNAi慢病毒表达载体的构建及鉴定

白志勋1陆静2杨亦彬1△

(1.遵义医学院附属医院肾病风湿科，贵州 遵义563000；2.遵义医药高等专科学校，贵州 遵义 563000)

目的 构建大鼠整合素连接激酶-RNAi(ILK-RNAi)慢病毒表达载体，为下一步干预研究细胞转分化及其信号通路奠定基础。方法 针对大鼠ILK基因RNAi有效靶序列，合成4条干扰(KD)序列。与pGCSIL-GFP 载体连接产生shILK-RNAi慢病毒载体。将连接产物转入制备完毕的细菌感受态细胞，PCR鉴定阳性克隆，测序验证。包装慢病毒，以绿色荧光蛋白(GFP)表达水平验证病毒滴度。慢病毒载体感染大鼠NRK-52E细胞后，RT-PCR、WB检测及荧光显微镜观察ILK在其细胞中的表达。结果 测序验证成功构建3条大鼠ILK-RNAi慢病毒载体，滴度分别为5×108，2.5×108，3.5×108pfu/mL。分别以不同感染复数(MOI)感染NRK-52E细胞进行内源筛靶，荧光观察80%细胞的绿色荧光蛋白，RT-PCR、WB检测ILK的表达明显下降。相对于阴性对照序列，KD2，KD3在高MOI组中对ILK表达的敲减达到65%以上(P<0.05)，为有效靶点。其中KD2及KD3的ILK 2-△△Ct值分别为0.337，0.217。KD2序列为对ILK的表达抑制最显著。结论 成功构建大鼠ILK-RNAi慢病毒表达载体。

NRK-52E； 整合素连接激酶； 慢病毒载体

整合素连接激酶(integrin-linked kinase, ILK)是一种生物学活性多样化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，共由452个氨基酸组成，其基因在人体位于染色体11p15.5-p15.4，cDNA 全长1.8 kb，分子量59 KD[1]。ILK在人体多个脏器及组织中具有广泛的表达，通过介导细胞骨架相关蛋白与整合素的连接参与多种信号通路的转导。近年来研究显示ILK可能是TGF-β信号转导途径中的一个重要效应因子，在TGF-β介导的EMT中发挥一定作用[2]。为了进一步研究TGF-β1/Smads/ILK信号通路中ILK的功能机制，本研究通过构建大鼠ILK-RNAi慢病毒表达载体，为后续研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料 引物设计及合成、干扰序列及对照序列DNA片段、慢病毒载体(GV115)由上海吉凯提供，慢病毒包装系统主要包括pHelper 1.0、pHelper 2.0 载体以及pGC-LV-GFP载体，其中pGC-LV-GFP载体中有能持续表达的绿色荧光蛋白。Taq polymerase(Takara)、QIAGN plasmid (QIAGN)、T4 DNA ligase、Age I、EcoR I(NEB)及阴性对照序列(TTCTCCGAACGTGTCACGT)由吉凯公司设计提供。

1.2 方法

1.2.1 siRNA干扰序列构建框架 根据Genbank中大鼠ILK基因序列(NM_133409)，利用美国英杰生命分析技术有限公司网站在线设计4对引物，见表1。

表1 siRNA干扰序列构建框架

将合成的引物干粉溶解于退火缓冲液中，在90 ℃水浴15 min，室温下冷却，引物形成双链DNA。

1.2.2 ILK慢病毒载体构建 载体酶切位点为Age I，EcoR I，质粒经单酶切消化后，会呈现均一的电泳条带，此时可与Marker对比判断其分子量大小，通过T4-DNA连接酶将双酶切后的载体与DNA片段在合适的buffer中进行连接反应，连接后的产物在16 ℃温度下过夜后进行转化实验。连接后产物将转化感受态大肠杆菌E.coil DH 5α(在含80 μg/mL氨苄青霉素抗性平板上涂抹均匀，在37 ℃的温度下培养6 h)。之后选取克隆菌落进行PCR检测及测序鉴定。

1.2.3 慢病毒的包装及滴度的测定 重组的慢病毒载体和包装质粒共同转染293T细胞，在转染后8 h内更换为完全培养基，再转染48 h。收集转染后48 h的293T细胞上清液应用超滤法浓缩病毒分装后放于-80 ℃冰箱中保存。将10 μL的病毒原液放置在第1个EP管中混匀，再从第1管中取10 μL混合液于下一EP管中混匀，后依次稀释病毒颗粒至第8管，将96孔板中的培养基吸出，每孔加90 μL病毒颗粒稀释液，培养24 h后更换为含10%FBS的完全培养液继续培养。在倒置荧光显微镜下观察GFP的表达量。

1.2.4 目的细胞NRK-52E慢病毒感染 将NRK-52E的细胞悬液接种于12孔板中，在 37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待目的细胞融合度达到约30%左右时，加入病毒。继续培养24 h后更换培养基培养，感染5 d后收集目的细胞，进行PCR检测。病毒感染前1天将NRK-52E 接种于6孔培养板培养。感染当天将细胞分为三个大组：(1)正常细胞组(未感染任何病毒)；(2)阴性对照组(正常目的细胞加阴性对照病毒)；(3)病毒感染组(正常目的细胞加RNAi靶点病毒感染，包括ILK-KD-1、ILK-KD-2、ILK-KD-3、ILK-KD-4共四组)。

1.2.5 内源筛靶RT-PCR验证 感染5 d后收集以上6个实验组对数生长期细胞1×107加入1 mL Trizol 匀浆后按照说明书提取总RNA。采用M-MμLV基因mRNA拷贝数检测。实验结果以Ct值为统计参数，按2-△△Ct法计算。

1.3 PCR阳性克隆进行测序分析 由上海吉凯基因化学技术有限公司完成。

2 结 果

RT-PCR及WB检测显示4条靶点干扰序列中，ILK-RNAi(2)、ILK-RNAi (3)敲减效率均>65%，本实验选用ILK-RNAi(2)为靶点干扰序列，以下就 ILK-RNAi(2)的构建结果做一说明：WB检测ILK-RNAi(2)、ILK-RNAi(3)在细胞中的敲减效率(见图1)。根据RT-PCR检测结果提示NRK-52E细胞中ILK基因为0.522，NC对照组转染后细胞ILK的2-△△Ct为1.00，KD2组细胞ILK的2-△△Ct为0.217，KD4组细胞ILK的2-△△Ct为0.337。(2)载体酶切结果：病毒经酶切后产物以1.2%琼脂凝胶电泳后，经凝胶成像系统，可见病毒经酶切后为单一条带，大小约8 kb(图2)。(3)阳性克隆PCR结果：根据测序结果以碱基形式表示ILK-RNAi(2) 序列为：CCGGAAGCTGTTGCAATACAAGGCTCTCGAGAGCCTTGTATTGCAACAGCTTTTTTTG(图3)。(4)慢病毒转染NRK-52E细胞后，镜下观察荧光表达情况：慢病毒感染NRK-52E细胞72 h后，能够观察到GFP稳定表达，空白对照组无绿色荧光表达，阴性对照序列病毒(NC-ILK)转染后未出现明显细胞病变效应，细胞生长形态正常，GFP表达正常。有效序列病毒(KD-ILK)转染后，细胞生长形态正常，GFP表达最强(见图4a～f)。

图1 KD-ILK有效序列转染细胞中的WB图

图2 载体酶切后电泳图 图3 阳性克隆电泳图

3 讨 论

目前，ILK作为细胞信号传导通路中的重要细胞因子，其作用机制的研究越来越受关注，作为一种新兴技术，RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)是一种通过由外源性或内源性双链小分子RNA特异性抑制靶蛋白的生成表达，进而导致相应蛋白合成的减少，从而达到基因表达沉默的调控技术[1]。慢病毒(lentivirus)载体介导RNAi作为现在常用的实验方式[3-5]。正是通过整合进入宿主基因组，进而达到长期稳定调控载体基因的表达。近年来在转基因动物、基因治疗等研究中得到广泛运用，并在这些领域中担任重要角色。

D.Zhang等[6]观察到在单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)模型肾小管间质纤维化过程中存在TGF-β1/Smads/ILK信号通路蛋白分子表达上调，赵敬等[7]研究发现，在脂多糖诱导足细胞上皮间质转分化的过程中存在着TGF-β1-Smad2/3-ILK信号通路。R.Ortega-Velazquez等[8]通过干预后下调TGF-β1表达，发现也同时会伴随ILK表达的相应变化，以上研究提示ILK不仅参与TGF-β1介导的信号通路，而且其表达受到TGF-β1的影响。TGF-β/Smads信号通路作为肾间质纤维化中的研究热点，目前多项研究正在寻找有效抑制该通路信号传导途径中的细胞因子及其下游产物表达的siRNA，尝试运用RNA干扰技术，抑制相应基因的表达，从而抑制或减缓肾间质纤维化过程，起到保护肾脏的作用。为了进一步研究TGF-β1/Smads/ILK信号通路中ILK的功能机制，本实验使用RNA干扰技术获得稳定降低ILK基因表达的NRK-52E细胞。

本实验中通过设计构建病毒干扰序列，经过酶切测序验证后成功构建ILK慢病毒载体。通过RT-PCR及WB验证慢病毒转染目的细胞后可引起ILK基因表达的下调，这次实验将为后续在肾间质纤维化等相关信号通路的机制研究中，提供重要的研究基础。

[1] 白志勋. TGF-β1/Smads/ILK信号通路在环孢素诱导肾小管上皮细胞转分化中的作用[D]. 遵义医学院, 2013：5.

[2] Serrano I, Mcdonald PC, Lock FE, et al. Role of the integrin-linked kinase (ILK)/Rictor complex in TGFβ-1-induced epithelial-mesenchymal transition (EMT) [J]. Oncogene, 2013, 32(1): 50-60.

[3] 朱守荣, 张芮, 曹永倩, 等. 慢病毒载体靶向携带 survivin-siRNA 对恶性黑色素瘤 A375 细胞的影响[J]. 山东大学学报：医学版, 2013, (5):54-57.

[4] 王晓萍,吴蔚,邵冰，等.慢病毒介导RNA干扰心房区心肌细胞Kir2.2基因对Kv2.1钾通道及内向整流钾电流的影响[J].中国老年学杂志,2013,(3):609-612.

[5] Zhu L, Jia X, Li J. Lentivirus-mediated shRNA targeting homeobox A9 gene enhances drug sensitivity of human acute monocytic leukemia U937 cells[J]. Tumor,2013, 33(1): 21-27.

[6] Zhang D, Sun L, Xian W, et al. Low-dose paclitaxel ameliorates renal fibrosis in rat UUO model by inhibition of TGF-β/Smad activity[J]. Laboratory Investigation, 2010, 90(3):436-447.

[7] 赵敬,王颖超,赵宗江,等. 糖肾平通过TGF-β1-Smad2/3-ILK信号通路干预高糖+LPS诱导足细胞上皮间质转分化的分子机制研究[J]. 中国中西医结合肾病杂志, 2014(5):392-396.

[8] Ortega-Velazquez R ,Gonzalez-Rubio M,Ruiz-Torres MP, et al. Collagen I upregulates extracellular matrix gene expression and secretion of TGF-beta 1 by cultured human mesangial cells.[J]. Ajp Cell Physiology, 2004, 286(6):C1335-1343.

Construction and characterization of RNAi lentiviral vector targeting rat ILK gene

BaiZhixun1,Lujing2,YangYibin1.

1.DepartmentofNephrology&Rheumatology,TheAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563000,Guizhou,China. 2.ZunyiFachhochschulofMedicine,Zunyi563000,Guizhou,China.

Objective To lay the basis for the following study on epithelial-mesenchymal transition and signal pathway through construction of RNA interference (RNAi) lentiviral vector targeting rat integrin-linked kinase (ILK)gene. Methods The complementary oligo DNA containing target sequence was designed, synthesized and cloned into the pGCSIL-GFP vector according to the effective sequence of small interfering (siRNA) targeting ILK gene. The obtained lentiviral vector which expressed short hairpin RNA containing ILK was confirmed by PCR and sequencing. All virus stocks were produced and then transfect into NRK-52E cells in vivo, the titer virus was tested according to the expression level of GFP. ILK expression was assayed by Real-time PCR and Western blotting. Results ILK interference vector was successfully constructed. The titer virus with was 5×108, 2.5×108, 3.5×108pfu/mL. ILK expression in NRK-52E cells could be knockdown by virus infection as characterized by more than 65% decrease of ILK mRNA. Compared with negative control lentivirus, the value expression of KD-2 and KD-3 were 0.337 and 0.217 respectively, the function of ILKsiRNA-2 was significant. Conclusion The recombinant lentiviral shRNA expressing vector targeting rat ILK gene has been successfully constructed and packaged.

NRK-52E; ILK; Lentiviral

贵州省教育厅自然科学研究项目( NO: 黔教科2010044),[遵市科合社字(2012)42号]

R392

A

1000-744X(2016)07-0675-03

2016-03-09)

△通信作者，E-mail:yyb1011@sina.com