蛋氨酸脑啡肽的免疫调节作用及应用新进展①

张克莹 都 健 单风平

(中国医科大学附属第四医院内分泌科,沈阳110032)

蛋氨酸脑啡肽的免疫调节作用及应用新进展①

张克莹 都 健 单风平

(中国医科大学附属第四医院内分泌科,沈阳110032)

蛋氨酸脑啡肽(Methionine enkephalin,MENK)最早在1975年被Hughes发现，由前脑啡肽衍生而来的5个氨基酸组成的内源性阿片肽[1]，正常体内含量极低，每毫升血浆含50～150 pg[2]。对MENK的早期研究是将其作为镇痛剂和神经递质来进行的，随着内分泌和免疫系统关系的研究发现，当抗原或有丝分裂原刺激免疫细胞时，淋巴细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞可以分泌产生MENK，MENK还可以调节某些细胞因子的分泌水平[3]，阿片受体在中枢神经系统和免疫系统及某些肿瘤组织和正常组织细胞中均有分布；随着神经化学和分子生物学技术的发展，尤其是基因剔除鼠的应用，许多研究证实阿片肽与细胞表面不同的受体结合后可以产生不同的生物效应，如调节免疫功能，抑制肿瘤细胞生长等，这些结果说明MENK参与免疫和神经内分泌系统的调节，具有免疫调节作用，也是一类重要的细胞因子。MENK的生物学功能使其在免疫系统相关疾病和肿瘤疾病的治疗上发挥重要的作用，并取得了一定的进展[4]。

1 MENK的免疫调节作用

内分泌系统通过控制刺激信号分子的表达调节免疫系统活性，同时反馈作用于内分泌系统，而且免疫细胞间也能通过细胞因子网络环相互作用，这有助于我们理解MENK对免疫系统的调节作用。蛋氨酸脑啡肽受体又称阿片生长因子受体(OGFr)，均为G蛋白偶联的7次跨膜螺旋结构，包括μ、δ和κ受体等几种亚型，适宜浓度下MENK与免疫细胞表面κ和δ受体结合，参与cAMP-PKA、Ca2+-钙调蛋白、PKC等信号调节通路，产生免疫调节作用[5]。

1.1 对巨噬细胞的作用 巨噬细胞属于专职抗原提呈细胞，具有抗原提呈、细胞毒性作用、细胞碎片清除、调节炎症反应维持稳态等生理功能[6]。MENK作为调节分子可使巨噬细胞通过自分泌或旁分泌方式调节其吞噬作用及表型极化。巨噬细胞具有2种极化表型，即经典活化的M1表型和替代性活化的M2表型。M1表型能产生促炎症分子如TNF-α、IL-12，主要诱导Th1应答，有利于清除细胞内病原体和肿瘤。M2表型主要产生抗炎症分子，例如IL-10、IL-1受体拮抗剂中和炎症反应，主要诱导Th2应答。1984年研究发现MENK可双向调节鼠腹腔巨噬细胞功能[7]。MENK在低剂量(10-9～10-7mol/L)可以增加抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用，此时MENK与δ受体特异结合，它的活性与鸟苷酸环化酶水平正相关。在高剂量(10-6～10-5mol/L)时作用相反，此时MENK活性不被特异δ阿片受体介导，而是通过钙离子通道，腺苷酸环化酶激活[8]。细胞表面的配体-受体相互作用在调节和表达巨噬细胞功能上起着重要作用，阿片受体也包括在这些巨噬细胞膜受体中。近期研究发现MENK与受体结合可刺激腹腔巨噬细胞的吞噬功能并刺激巨噬细胞释放H2O2和NO的产生，这两种活性物质与巨噬细胞杀菌和抗肿瘤作用相关[9]。另外，MENK增加巨噬细胞产生IL-1、IL-6和TNF等细胞因子，增加巨噬细胞和中性粒细胞的趋化作用[10]。Shan的团队研究表明在体内实验MENK能下调肿瘤相关巨噬细胞CD206的表达和精氨酸酶-1(M2标志物)的产生，同时上调CD64、MHC Ⅱ的表达和NO合酶(M1标志物)的产生，在体外MENK可促进骨髓源性巨噬细胞介导的细胞毒性作用[11]。MENK可通过抑制由IL-4介导的STAT6信号通路的激活，有效上调NF-κB的表达，有利于M1型细胞因子和NF-κB位点的结合，从而有效调控巨噬细胞由M2型向M1型转化[12]。总之，MENK能有效地诱导M2巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞，继而调节宿主免疫系统Th1细胞免疫应答，显著促进巨噬细胞介导的细胞毒性作用。

1.2 对T淋巴细胞的作用 1979年Wybran等[13]发现人血T淋巴细胞表面存在MENK受体将神经内分泌与免疫系统联系在一起。有实验表明，MENK体内外应用均能增加小鼠CD4+T细胞数量，CD4+T细胞mRNA表达量，说明可促进CD4+T细胞增殖[14]。MENK可以通过T细胞有丝分裂加强淋巴细胞增殖[15]，还可增加活性T细胞玫瑰花节形成率而增加T淋巴细胞活性，同时MENK还可以加强人外周血T淋巴细胞的迁移，这种活性可能依赖肽的NH2终端序列，尤其是对δ和μ阿片受体。Shan等[16]发现当MENK单独使用、MENK与IL-2或IFN-γ联用时，可以显著增加CD4+T细胞的扩增及分子表达，通过直接或间接途径促使其他免疫细胞如巨噬细胞、树突状细胞分泌IL-2、IFN-γ；还发现MENK可以激活T细胞，增加对鼠S180肿瘤细胞的细胞毒性作用，增加鼠的生存率[17]。分子显像证实δ受体和κ阿片受体在T细胞表面主要呈现可调节表达。MENK体外刺激能促进小鼠CD4+T细胞阿片受体mRNA转录的高表达[18]；Li等[17]通过研究发现，MENK与表达增多的阿片受体结合后在CTL活化中起到关键作用；Zagon[19]证明阻断阿片受体轴能抑制T细胞增殖。可见MENK对免疫细胞的调节作用，不仅能增加CD4+T细胞的数量，同时也通过增加其表面阿片受体的含量来间接调节。CD4+Foxp3+调节性T细胞是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群。最近，在大鼠及人类肿瘤模型表明Foxp3+Tregs的数量在外周血、骨髓、肿瘤外周淋巴结和肿瘤组织均有所增加[20]。因此Tregs成为肿瘤免疫治疗的一个致命障碍。我们的研究认为MENK能抑制大鼠Tregs的活性和通过下调Tregs抑制肿瘤的进展[4]，还能通过抑制Tregs调节肿瘤患者外周血淋巴细胞亚群，延长大多数肿瘤患者的生命[21]。

1.3 对NK细胞的作用 NK细胞具有直接杀伤靶细胞的作用，能够通过释放含穿孔素蛋白和颗粒酶的颗粒或FasL诱导凋亡的非特异性杀伤，还可以通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，利用细胞表面的IgG Fc受体来识别与抗体特异性结合的靶细胞。因此，作用于任何途径都能调节NK细胞介导的杀伤活性，使调节NK细胞能应用于肿瘤及免疫相关疾病的治疗。1988年Faith[22]发现MENK能激活NK细胞、加强NK细胞的活性、抑制肺转移癌进展。Hua等[23]发现在10-12mol/L时，MENK实验组的NK细胞阳性率明显增高。在研究癌症患者免疫细胞时，通过FCM检测NK细胞(CD16+、CD56+)表面标志物发现用MENK治疗后癌症患者体内NK细胞百分率明显增加[21]。体内注射MENK能增强流感病毒A感染小鼠的NK细胞活性[24]。接下来的许多研究支持MENK在适宜浓度时能加强正常机体和癌症患者外周血中NK细胞活性，上调免疫系统功能，特别是对于NK细胞水平很低的患者，这种活性的提升更为显著，促进分泌细胞因子如IL-2、IL-12和TNF-α[25,26]。

1.4 对树突状细胞的作用 树突状细胞(DC)是一类成熟时具有许多树突样突起的、能够识别、摄取和加工外源性抗原并将抗原提呈给初始T细胞并诱导T细胞活化增殖的、功能最强的抗原提呈细胞。成熟DC可加强组织相容性复合体MHC和共刺激分子CD40、CD80/CD86高表达、迁移到次级淋巴器官激活T细胞分化为Th1及Th2，因此促进DC成熟有助于发挥其体内免疫调节作用[27]。Meng等[28]发现MENK具有双向调节的作用，在生理浓度为10-15～10-11mol/L时能促进DC细胞增殖成熟，当浓度高达10-6或低于10-18mol/L时会延迟树突状细胞的生长。MENK刺激下，DC的突起增多、CD40、CD80和MHCⅡ共刺激分子的表达增加，提示MENK促进了DC的成熟，增强其免疫学功能成熟，RT-PCR实验显示MENK能够增加骨髓源性树突状细胞δ、κ受体的表达，分泌更高水平的促炎细胞因子IL-12P70、TNF-α[29-31]。体内外实验表明MENK可以诱导DCs主要极化为髓样树突状细胞mDC亚型，而不是浆样树突状细胞pDC，这有利于Th1细胞介导的免疫反应[31]。Toll样受体(TLRs)表达于树突状细胞表面，可以通过上调DC表面的MHC Ⅱ 类分子和共刺激分子，促进DC的成熟，指导抗原特异的免疫应答尤其是Th1型反应的产生。MENK可以促进树突状细胞TLR-4的表达，TLR-4活化后激活NF-κB信号通路，上调了Th1型细胞因子的表达和释放，激活获得性免疫系统将病原体及其产物清除[32]。

1.5 对B淋巴细胞的作用 B细胞在骨髓内发育历经从淋巴样前体细胞到未成熟的B细胞，之后迁移到外周免疫器官与组织如淋巴结、脾发育成熟至细胞表面出现完整的IgM、IgD分子，具有分泌抗体、提呈抗原和免疫调节等功能。Gabrilovac等[15]在对雌性和雄性鼠分别予以MENK后发现，雄性鼠LPS刺激的脾源性B淋巴细胞的增殖能力增强，但在雌鼠中作用相反；同时，若在注射MENK之前注射纳曲酮该增殖作用会被可逆性抑制。Zagon等[33]研究发现MENK对B细胞生长具有双向调控作用，即在低浓度时抑制细胞生长，高浓度时却促进细胞生长。适宜浓度的MENK能通过与受体作用增加CD2、CD4、CD8等受体分子的表达。

1.6 对细胞因子的作用 MENK通过影响细胞因子的释放间接调控免疫反应和细胞增殖。IL-2是免疫调节中起重要作用的细胞因子，它能激活多种免疫细胞，特别是诱导T淋巴细胞增殖，发挥免疫效应；同时能促进巨噬细胞和NK细胞等的增殖，还具有诱生分泌多种细胞因子等免疫活性物质的作用，通过复杂的免疫调节使机体表现出抗感染、抗肿瘤、改善免疫功能和状态等。有研究发现，MENK能促进人T细胞IL-2分泌和IL-2受体高表达[16]。MENK还能够增强DC对IL-12的分泌，IL-12是DC的功能性产物，其含量的增高以及抗原提呈功能方面的成熟和形态学上的成熟是对应的，IL-12含量的增加可以进一步促进CD4+T细胞增殖，增强CTL杀伤活性，刺激T细胞和NK细胞产生IFN-γ，抑制IgE合成[30]。IFN-γ是一种具有免疫调节作用的干扰素，主要由活化的Th细胞和NK细胞产生，其生物学功能主要是免疫调节，诱导多种抗原提呈细胞表达MHCⅠ/Ⅱ类分子，活化单核-巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞，促进Th1细胞发育和抑制Th2细胞活化和增殖，刺激B细胞产生的抗体类型向调理素方向转变。

2 对免疫相关疾病的作用

2.1 抗肿瘤 1980年后大量研究发现MENK参与肿瘤细胞生长调控。Zagon等[18]使用多种癌细胞系，通过一系列体内外实验证明，MENK通过与其受体结合抑制肿瘤细胞增殖。MENK治疗一段时间可使肿瘤发生率降低，肿瘤周期延长，同时能延长施药对象的生存期。阿片生长因子(OGF)是肿瘤形成的抑制因子，OGF-OGFr轴能通过延迟细胞周期G1/S期来紧张性地调节细胞增殖。对胰腺癌的研究发现，OGF亦可直接通过增加P21周期蛋白依赖抑制性激酶或减少细胞周期依赖性激酶CDK-2的作用方式抑制DNA合成和胰腺癌细胞增殖[34]。Donahue等[35]在研究卵巢癌时发现，对荷瘤鼠以MENK治疗后肿瘤结节数量减少42%，肿瘤累积重量减少69%，可以看出OGF能在很大程度上抑制肿瘤的发生与发展。肝母细胞瘤是2岁以下儿童最常见的恶性肝脏肿瘤，手术联合化疗能显著提高生存率，但传统化疗药物的毒性诱导中性粒细胞减少，严重增加全身性感染的几率及其并发症，而应用MENK在抑制肿瘤细胞生长的同时不会引起类似副反应[36]。对甲状腺癌的研究发现，OGF-OGFr轴也存在于甲状腺未分化癌ATC细胞中，可逆性地以受体介导的剂量依赖性方式，10-6mol/L时96 h的周期内OGF对肿瘤细胞复制抑制率达到13%-30%[37]。神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外肿瘤，属于神经内分泌性肿瘤，MENK对SH-SY5Y瘤细胞的生长有明显的抑制作用，主要将细胞抑制于生长周期的G0/G1期，并通过影响细胞周期相关蛋白及酶类表达和活性(p21Waf1/Cip1、p16INK4a蛋白表达量增加，磷酸Rb蛋白表达量降低，细胞内SOD酶活性增加)和钙离子浓度等多种途径发挥抑制细胞增殖的作用[38,39]。体外实验还证实MENK与化疗药物联用可增强药物的抗肿瘤效果[40,41]。MENK通过将细胞抑制于生长周期的G0/G1期对乳腺癌MCF-7/ADR细胞发挥抑制细胞生长作用[42]。基于MENK 对免疫细胞的调节恢复作用，对于因放疗化疗免疫系统受损的癌症患者而言，MENK将有望作为治疗物帮助恢复紊乱的免疫系统，同时可辅助化疗，减少其副作用。

2.2 抗自身免疫病 多发性硬化症是一种慢性、炎症性、自身免疫性疾病，由于目前病因未明仍缺乏特异性疗法。MENK被报道可以改善小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎症状，治疗机制与抑制星形胶质细胞增殖有关[3]。应用代谢组学分析显示，MENK治疗后通过配体-受体途径可增加细胞内酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸及甘氨酰甘氨酸含量，甘氨酰甘氨酸可抑制星形胶质细胞细胞增殖，增加髓鞘再生相关基因的表达，从而发挥对多发性硬化症的神经保护作用[43]。OGF-OGFr轴可通过与P16、P21这一类周期素依赖性激酶抑制物相互作用，而在细胞分裂的G1期参与调节，最终抑制细胞增殖，以紧张性激活的方式抑制用PHA植物素刺激的T细胞增殖，严格地维持着细胞更新与恢复机制，从而抑制小鼠的实验性自身免疫性脑脊髓炎，进而调节自身免疫病[19]。

2.3 抗AIDS 获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的，患者受到HIV感染后体内CD4+T细胞显著减少，导致体液和细胞免疫功能均出现缺陷，感染者免疫力低下，因此提高机体免疫力可减少机会感染、延长HIV感染者的生存时间。有报道刺激OGFr可抑制淋巴细胞中该病毒的增殖[44]。在对AIDS患者应用MENK治疗后发现外周血中的CD4+T细胞亚群的活性和数量有显著增加，可以延缓病程、减轻症状[45]，MENK所具有的镇痛作用还有利于缓解患者晚期的疼痛。Li等[46]研究MENK延长猿免疫缺陷病毒(SIV)感染淋巴细胞生存的信号通路，结果显示MENK明显增加细胞内钙含量并保持在高水平，同时提高PKC活性水平和磷酸化的胞间信号调节激酶水平，所以MENK使细胞生存率显著增加可能是通过Ca2+-PKC-MAPK级联作用在病毒感染早期阶段发挥作用。多年研究总结出一套有效提高机体免疫力的方案，该方案是通过间歇使用MENK来诱导可持续的免疫应答，可应用于所有与免疫力低下有关的疾病的治疗[45]。

2.4 抗炎症、抗微生物感染作用 炎症是机体对损伤因子产生的防御性的反应，是一种损伤与抗损伤的统一表现。MENK 通过调节促炎症和抗炎症细胞因子来调节炎症反应[47]。白细胞分泌的MENK在炎症反应中起到镇痛和免疫调节的重要作用[48]。Owczarek等[49]通过对比溃疡性结肠炎及克罗恩氏病患者肠炎病灶切片后发现，MENK的含量明显高于非炎症部位。Spetea等[50]研究发现关节炎接种鼠的纹状体、额皮质和枕皮质组织MENK含量增加，最为明显的是腰部脊髓中MENK增加达到232%。有文献报道，适宜剂量的MENK与重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子联合应用，对疟原虫感染的小鼠具有较好的疗效，该治疗组小鼠巨噬细胞的吞噬活性显著增强[51]。MENK在流感病毒感染的小鼠中能通过免疫调节发挥间接抗病毒作用[52]。以上发现均表明MENK在炎症反应与抗炎症反应的平衡调节中发挥着重要的作用。

2.5 肥胖症的治疗 新兴的研究表明免疫细胞包括单核细胞、粒细胞和淋巴细胞可以调控代谢稳态及肥胖症。两组先天淋巴细胞(ILC2s)存在于人类白色脂肪组织，研究发现ILC2s可产生MENK直接作用于脂肪细胞上调Ucp1的表达、促进白色脂肪组织褐色化，增加热量消耗从而限制肥胖症；同时发现内生的IL-33对于维持正常白色脂肪组织内ILC2反应和限制自发性肥胖症的发展是必要的，IL-33刺激后ILC2产生MENK量明显增加[53]。因此对于IL-33/ILC2/褐色化途径的目标调节可以为肥胖和肥胖相关疾病的治疗提供新方法。

MENK的生物学功能已经比较确定，其临床应用也取得了一定进展。糖尿病患病率在全球快速增长并成为严重危害我国人民身体健康的疾病，2型糖尿病是一种免疫相关性慢性炎症性疾病，免疫细胞介导的β细胞的免疫损伤可能在2型糖尿病的发生与发展中起核心作用。基于MENK介导的免疫干预作用，所以从理论上对于存在免疫损伤缺陷的糖尿病患者而言，MENK将有望作为治疗物来帮助恢复紊乱的免疫系统，起到辅助降糖作用提供一个新的思考方向。相信随着对MENK研究的不断深入，将进一步阐明其免疫调节机制，提高MENK的治疗效果和扩大其应用领域。

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[收稿2016-12-20 修回2017-01-18]

(编辑 张晓舟)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.034

①本文受辽宁省科技厅公益项目(2014001016)和辽宁省教育厅项目(L2015567)资助。

张克莹(1985年-)，女，在读博士，主治医师，主要从事糖尿病与免疫调节治疗方面的研究，E-mail：drzhangky@163.com。

及指导教师：都 健(1962年-)，女，博士，教授，博士生导师，主要从事糖尿病治疗研究， E-mail：dujian.com@medmail.com.cn。 单风平(1959年-)，男，博士,教授，博士生导师，主要从事抗肿瘤免疫研究， E-mail：profshan9@163.com。

R392.6

A

1000-484X(2017)05-0788-05