牛支原体实验室检测方法研究进展

庄金秋，梅建国，刘吉山，姚春阳，马力(山东省滨州畜牧兽医研究院，滨州 256600)

牛支原体实验室检测方法研究进展

庄金秋，梅建国，刘吉山，姚春阳，马力
(山东省滨州畜牧兽医研究院，滨州 256600)

随着规模化养牛业的不断发展，牛支原体已经成为危害养牛业的一种重要致病性支原体，可导致牛肺炎、乳腺炎、关节炎等多种疾病，造成巨大的经济损失。本文综述了牛支原体病原学、血清学及分子生物学方面的实验室检测方法研究进展，以期为我国牛支原体病的防治提供参考。

牛支原体；检测；研究进展

牛支原体（Mycoplasma bovis，M. bovis）属支原体科支原体属，是一种介于细菌和病毒之间的无细胞壁的原核微生物。M. bovis可引起犊牛肺炎、乳腺炎、关节炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎甚至流产与不孕等多种疾病，这些疾病常被称为牛支原体相关疾病（Mycoplasma bovis-associated disease，MbAD）。牛传染性胸膜肺炎（Contagious bovine pleuropneumonia，CBPP）简称牛肺疫，是由与M.bovis同属的丝状支原体丝状亚种SC型（Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC，MmmSC）引起的烈性传染病，被世界动物卫生组织（OIE）列为须通报的动物疫病。M. bovis是继MmmSC对牛致病力最强的支原体，二者具有相似的临床症状和病理剖检变化，不易鉴别诊断。1961年Hale在美国首次从一例患乳腺炎患牛的牛乳中分离出M. bovis[1]。1976年美国首次报道M. bovis引起的肺炎。我国黎济申等[2]于1983年从患乳腺炎的牛乳中首次分离到该病原，辛九庆等[3]于2008年从患肺炎的犊牛肺脏中首次分离到该病原。M. bovis是危害犊牛的重要致病性病原体，具有较高的感染率和死亡率，而经治疗后症状缓解的牛一般发育迟缓，甚至成为废牛，严重影响牛奶的产量和质量。该病呈世界性分布，近年来MbAD已经在世界范围内广泛传播，且M.bovis感染后可明显增加其他病原的继发感染，给世界养牛业造成了巨大的经济损失。牛支原体感染后无特殊症状，因此很难对该病进行感官判断，确诊需借助实验室诊断。本文综述了近年来M. bovis感染最新实验室检测方法研究进展，以期对疾病的预防控制提供参考。

1 牛支原体分离鉴定

支原体分离鉴定方法应严格按照无菌操作规程，将患病动物的组织病料接种于培养基中。支原体培养营养需求较高，通常要在培养基中加入10%～20%马血清，置于37℃、5%CO2培养箱中培养3～5d。在类胸膜肺炎微生物（Pleuropneumonia like organism，PPLO）固体培养基中进行分离培养时，在光学显微镜下，菌落呈现典型的“煎蛋状”形态，边缘整齐，表面光滑，为中间厚周边薄的菌膜斑点。如若7d未发现生长迹象，可判断为阴性。初步鉴定后，在含酚红的液体培养基中培养，观察培养基颜色是否由红变黄，且稍浑浊，而后根据配套的生化反应进行鉴定。常用的液体培养基包括Hayfiick、Edward、Frey、MEM-KMZ、SP-4等培养基。M. bovis对外界环境要求较高，采集病料如未能及时送往实验室，则极易导致病原死亡。病料一般需冷藏运输，运输时间不要超过24h，也可将其冻存于运输培养基中进行运输。对于病料的采集，下呼吸道分离出病原的概率一般比上呼吸道大。虽然牛支原体分离鉴定可以确诊是否有M. bovis的感染，但是其分离难度大且周期长，不能作为快速诊断M. bovis感染的有效方法来使用。

2 血清学方法

血清学方法是检测M.bovis感染的可靠方法，尤其对于经抗生素治疗或慢性病例，血清抗体检测方法比病原培养方法更敏感。

2.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）

利用全菌抗原或重组抗原建立的间接ELISA方法是检测血清抗体的首选方法，应用最为广泛。用处理过的M.bovis全菌蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法不仅能够检测血清抗体，还可以检测患有乳腺炎奶牛的乳清抗体，此方法被广泛应用于M.bovis感染的流行病学调查，但是该方法的抗原为全菌蛋白，其特异性有待提高。基于此，Brank等[4]建立了以M.bovis的VSP重组蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法，Robino等[5]建立了以M.bovis的膜脂蛋白P48作为包被抗原的间接ELISA用以检测对应抗体。Fu等[6]利用P48重组蛋白作为包被抗原，其相应的单克隆抗体用HRP进行标记，建立了直接竞争ELISA检测M.bovis抗体的方法，与其他两种商品化ELISA试剂盒比较，该方法具有更好的特异性和更高敏感性。以P48蛋白作为包被抗原的ELISA方法能检测M.bovis的所有分离株，但是不与感染牛的其他支原体发生反应，在检测M.bovis感染上有很好的应用前景。Wawegama等[7]鉴别出一种可以具有脂肪酶活性的膜蛋白（mycoplasma immunogenic lipase A，MilA），该蛋白氨基末端与M. bovis抗体有很强的免疫反应，利用大肠杆菌诱导表达该段蛋白建立了间接ELISA方法，敏感性达到92.86%，特异性高达98.7%。金云云等[8]以M.bovis全菌蛋白经超声波裂解后的裂解物作为包被用抗原，建立了检测M.bovis血清抗体的间接ELISA方法。Han等[9]基于全菌蛋白建立了一种间接ELISA方法，特异性好，而且可以区分出感染牛和免疫牛，从而可以判断牛感染程度高低、疫苗有效与否。国外商品化的检测M. bovis抗体的ELISA试剂盒有瑞士、加拿大和比利时等国家研制的试剂盒。国内刘洋等[10]将纯化后的P28重组蛋白作为抗原建立了检测M.bovis血清抗体的间接ELISA方法并组装成试剂盒，填补了国内ELISA试剂盒的空白。该试剂盒具有良好的敏感性、特异性和稳定性，能在一次反应中对M.bovis和MmmSC作鉴别诊断，与加拿大商品化试剂盒的检测结果符合率高达92%，各种技术指标相当，认为可作为进口试剂盒的替代品用于M.bovis的临床诊断与流行病学调查。

2.2 间接血凝试验（IHA）

IHA是一种经典的免疫学诊断技术，因其操作简单、稳定、成本低，具有较高的敏感性和特异性，且对试验条件要求低，可被广泛应用于兽医实验室检测、田间血清学调查和基层兽医部门的辅助诊断。简莹娜等[11]以纯化的P48重组蛋白致敏醛化-鞣酸化的绵羊红细胞并对其工艺进行优化，建立了检测M. bovis抗体的IHA方法。该方法与国外商品化的ELISA试剂盒比较，平均符合率为96.15%。对833份田间血清和1 084份乳清进行检测，阳性率分别是15.37%和19.56%。该方法敏感性高、特异性强和重复性好，可用于M. bovis抗体水平监测、牛支原体病的辅助诊断和流行病学调查。

2.3 胶体金免疫层析试纸条

简莹娜[12]利用牛支原体P48重组蛋白，建立了检测M. bovis抗体的胶体金免疫层析试纸条。应用该试纸条检测临床血清200份，乳清108份，阳性率分别是21.50%、17.59%，与IHA方法相比符合率为96.53%。表明该试纸条敏感、特异、快速，适合于M. bovis抗体的快速检测。

2.4 免疫组化技术

免疫组化技术是一门将免疫学与组织化学相结合的技术，可在组织细胞原位通过抗原-抗体特异性结合反应和组织化学显色反应、借助可见的标记物对相应抗原或抗体进行定位、定性和定量检测，不仅能准确地判断是否有病原感染，而且还能清晰地反映病原在组织器官和细胞中的定位及分布。该方法操作简便、不需要专门的仪器设备，适合于基层临床的快速诊断，并且对于研究病原在机体内的致病机制及分布规律有一定的辅助作用。Adegboye等[13]基于单克隆抗体建立了免疫组化方法检测犊牛肺组织中的M.bovis，与殊异支原体阳性、牛鼻支原体阳性以及牛支原体阴性的牛组织切片等没有交叉反应，且直观反映出病原的分布。Haines等[14]建立了M.bovis免疫组化技术，对牛场M.bovis感染所致的急慢性呼吸道疾病、肺炎、乳腺炎等进行了病原体检测，其检测结果提示，病原体数量、定植部位与病理损伤程度、致病机理等之间可能存在联系。Khodakaram-Tafti等[15]采用免疫组化方法进行M.bovis的诊断，不仅能对福尔马林固定的组织进行M.bovis检测，还能清楚地显示出M.bovis在病灶内的具体位置，该方法能够定位抗原、直观地观察病变组织的病理变化以及M.bovis侵袭机体后的分布情况。金云云等[16]以鸡抗M.bovis IgY为一抗，以HRP标记的羊抗鸡IgG为二抗，建立了检测M.bovis的间接免疫组化法。该方法可用于检测临床病例组织样本及培养物中的M.bovis，为探究该病原在机体内的定位、动态分布规律及致病机理提供了手段。

2.5 其他血清学方法

其他血清学检测方法有应用兔源高免疫血清鉴定M.bovis的抗体检测方法，包括生长抑制试验（GI）、生物膜形成抑制试验（FI）、荧光抗体试验（FA）和新陈代谢抑制试验（MI）等。由于这些试验无商品化抗血清，需在实验室自行制备，因此操作时较为费时费力。

3 分子生物学方法

由于牛在养殖场环境中停留2～4周后都存在可检测滴度的M.bovis抗体，所以血清学检测方法无法对牛肺炎病例是否由M.bovis引起进行准确的诊断。分子生物学方法相对快捷方便，而且灵敏度高，已被广泛应用于M.bovis的实验室检测。

3.1 PCR技术

早期Hotzel等[17]、Ayling等[18]利用PCR方法扩增16S rRNA用来检测M. bovis的感染，但是由于M.bovis与无乳支原体（Mycoplasma agalactiae，M.agalactiae）的16S rRNA同源性高达99.8%，在不结合其他方法的情况下无法区分这两种病原的感染。于是Johansson等[19]通过16S rRNA的PCR和酶切系统来鉴别这两种支原体。Subramaniam等[20]选取了DNA修复基因uvrC作为靶基因进行特异性扩增，可以直接应用于临床患病牛的病原学检测。Pinnow等[21]建立了套式PCR的方法，能够快速、准确地鉴定是否由M.bovis引起的乳腺炎。Bashiruddin等[22]建立了ATP结合蛋白oppD/F基因作为靶基因的PCR方法。Foddai[23]等根据M.bovis的p81基因，设计建立了多重PCR和PCR-RFLP方法，能够在一次反应中对M.bovis和M.agalactiae作鉴别诊断。我国从2008年开始对M. bovis进行深入研究，P81蛋白是M.bovis和M. agalactiae共有的蛋白，但两者的同源性仅为67%。李媛等[24]根据P81基因引物，建立了PCR方法。该方法可以从人工感染牛的鼻拭子和临床发病牛肺中扩增出目的片段，与分离培养结果完全符合，为国内首次建立的敏感、特异、快速的牛支原体PCR检测方法。同年利用oppD/F为靶基因，设计2对引物，建立了套式PCR检测方法，成功鉴别了M.bovis和M. agalactiae。李彦芹[25]利用通用引物扩增16S rRNA建立了能够快速鉴别诊断MmmSC、M.bovis、M. agalactiae和绵羊肺炎支原体的多重PCR方法，可以对临床病例中怀疑支原体感染的病料进行病原诊断。刘洋等[26]建立了可以同时鉴别检测M.bovis 和MmmSC的双重PCR方法，为我国的牛肺疫认证以及M. bovis相关疾病诊断提供了技术支持。李大伟等[27]也建立了一种可一次性区分上述三种支原体的三重PCR方法，用于临床诊断和流行病学调查。胡国明[28]根据牛支原体P48基因设计引物，建立了M.bovis与M.agalactiae、MmmSC、滑液支原体、鸡毒支原体等病原的PCR鉴别诊断方法，经对西固、临洮、武威等地的临床病料进行检测，证明具有很高的特异性和敏感性，对M.bovis感染的临床快速、准确诊断具有较高的实用价值。

3.2 荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR技术也被用于M.bovis检测的研究。Cai等[29]应用杂交探针和退火温度建立了扩增16S rRNA基因序列的实时定量PCR方法，用于检测奶牛牛乳以及肺组织中的M.bovis。在检测牛乳时，其敏感性达100%，检测肺组织时，其敏感性达96.6%。Sachse等[30]针对oppD基因，设计了实时定量PCR引物及探针，在患乳腺炎及呼吸道疾病的病牛中，能够灵敏特异地鉴别出M.bovis，检测限能够达到100cfu/mL。Rossetti等[31]根据uvrC基因设计引物，建立了实时定量PCR方法，该方法不需要处理牛乳及组织样品即可获取纯化的DNA，可直接用于实时定量PCR检测，具有良好的特异性和高度敏感性，方便用于M.bovis的检测。

3.3 环介导等温扩增（LAMP）技术

LAMP方法具有操作简便、快速、高效、敏感、特异、经济等特点，适于基层实验室监测的广泛使用。Saito等[32]利用LAMP对肺炎支原体进行检测，相同时间内LAMP检测法的灵敏度远高于实时定量PCR法。在对70例患者及25例正常人咽试纸检测中，阳性率100%，无假阳性。Churchward等[33]同时用竞争性ELISA、套式PCR及LAMP对丝状支原体进行诊断，结果显示，LAMP法的敏感性远高于竞争性ELISA和套式PCR。国内白智迪[34]、侯轩等[35]先后根据M.bovis的uvrC基因设计引物，建立了LAMP方法，敏感性较PCR方法高100倍。在对167个临床鼻拭子样本的检测中，LAMP方法检测结果的阳性率（26.95%）高于PCR方法检测结果的阳性率（19.16%）。金云云等[36]根据P81基因设计引物建立了LAMP方法，最低检出限为1.1ng/L。

3.4 双向电泳技术

陈维等[37]成功建立了M.bovis蛋白质组学双向电泳技术，由于国际上目前尚无M.bovis蛋白组学的相关报道，所以该方法的建立，可以鉴定出相应的致病性蛋白，为M.bovis致病机理的研究提供了蛋白质组学信息。

4 小结

随着规模化养牛业的不断发展，牛支原体病的流行范围越来越广，发生频率也越来越高，严重威胁了我国养牛业的发展。现阶段国内外对该病原的研究还不透彻，特别是对牛支原体疫苗及其遗传稳定性的研究几乎处于零阶段，加之我国对于本病的研究起步较晚，并且国际上尚无公认的特异性诊断方法，以及目前对于该病致病机制的研究尚未达成共识，从而为该病的预防控制带来了不便。因此建立快速、准确的检测方法，开发新型疫苗等防控产品，是控制该病发生的基础和关键，具有十分重要的意义。上述M.bovis的各种检测方法各有优点和实用性，实际应用中需根据不同的场合、条件等选择使用其中的一种或者多种方法。随着人们对M.bovis研究的深入，相信现有的检测方法将不断得到改进，更简便化、快速化和准确化的检测方法也将很快被研制出来。

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Research Progress on the Detection Methods of Mycoplasma Bovis

ZHUANG Jin-qiu, MEI Jian-guo, LIU Ji-shan, YAO Chun-yang, MA Li
(Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy, Binzhou 256600)

With the development of cattle movement, Mycoplasma bovis has been became an important pathogen to damage to the breeding. Associated with a number of bovine diseases, Mycoplasma bovis is the most commonly implicated in pneumonia and mastitis, form which arthritis may result, so that it bright a huge economic loss. This paper summarized the research progress on the detection of the Mycoplasma bovis in terms of etiology, serological and molecular biology so as to provide references for prevention and control of Mycoplasma bovis infection in China.

Mycoplasma bovis; Detection; Research progress

S858.23

A

1004-4264（2017）02-0030-05

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.02.008

2016-07-29

山东省现代农业产业技术体系牛产业创新团队项目（SDAIT-09-12）；山 东 省 重 点 研 发 计 划 项 目（2015GSF121027）。

庄金秋（1978-），女，山东潍坊人，硕士，副研究员，主要从事细胞培养和动物用病毒疫苗研制工作。