高通量测序技术在猪miRNA功能研究中的研究进展

许 栋，何 俊，贺长青，马海明

（湖南农业大学动物科学技术学院，湖南 长沙 410128）

高通量测序技术在猪miRNA功能研究中的研究进展

许 栋，何 俊，贺长青，马海明

（湖南农业大学动物科学技术学院，湖南 长沙 410128）

miRNA的研究是近几年生命科学领域的研究热点，该文对miRNA的形成及作用机制进行了论述。当前研究miRNA最主要的手段是高通量测序技术，文章对该技术的起源、发展、原理、分类及近几年在猪miRNA功能研究中的应用进行了综述。高通量测序技术的出现促进了基因组学研究领域的发展，目前已成为猪转录组研究的重要手段，为猪的基因组学研究提供了一个高效的平台，为当前猪品种遗传改良、辅助育种选择工作提供了数据基础。

猪；高通量测序技术；miRNA

随着人类基因组计划（human genome projiect，HGP）的提出，数量庞大的基因组计划需要更强大的技术支撑和数据分析软件，高通量DNA序列分析技术（High-throughput DNA sequence analysis technology）的突破，使得人类基因组计划得以完成。该技术是基于Sanger的双脱氧链终止法发展起来的，利用了DNA聚合酶的双脱氧链终止原理来测定核苷酸序列。自从1993年在秀丽新小杆先虫中发现了第一个miRNA lin-4，基因的表达调控出现了一个新的研究领域—microRNA调控。miRNA通过与靶基因的3’端碱基互补配对，从而调控靶基因的表达。在过去的十几年间，整个生命科学领域的研究热点大多集中在对miRNA的研究上，一些新的研究技术应运而生。

1 高通量测序技术

高通量DNA序列分析技术成为了挖掘miRNA的主要手段，但由于其成本高、耗时长、检出效率低，市场上出现了一些改良后的新高通量测序平台，如罗氏公司发开的454技术，Illumina公司的Solexa Genome Analyzer技术、ABI公司的SOLID System技术等等，都是目前市场上运用最广泛的miRNA研究手段。这些测序技术被称作下一代测序技术（Nextgeneration sequencing，NGS），又名深度测序技术（Deep Sequencing），属于第二代测序技术。

罗氏公司于2005年推出的454测序技术开创了第二代测序技术的先河，该技术是基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统。454测序技术的原理是依靠一系列酶的协同作用，在每一轮测序反应中只加一种dNTP，与模板配对就能释放一次荧光信号，通过检测荧光信号获得DNA序列，其优点是读取序列长度可达600～1 000 bp，但是通量很低。此后，Illumina公司推出了Solexa Genome Analyzer技术，其主要原理是边合成边测序，在生成新的DNA互补链时，加入的dNTP通过酶促级联反应催化底物释放出荧光信号，或者通过直接加入有荧光标记的dNTP或半简并引物，在合成互补链时发出荧光信息，利用采集到的荧光信号来获得序列信息，其优点是测序通量大，结果较准确，但读取序列长度通常只有100～200 bp。ABI公司研发的SOLID System技术，与焦磷酸测序的原理类似，主要采用双碱基编码的原理，通过寡核苷酸连接和荧光信号的检测进行测序，其结果的准确率大大提高，但其读取序列长度最短，仅50 bp左右。

第二代测序技术的出现大大减少了实验成本和缩短了实验时间，通过实验获得的产物无需进行电泳，直接通过收集的荧光信号值就能获取序列信息，单次反应中可以对大量的样品进行同时分析，这是传统的测序仪所不能达到的，此外，也不用像基因芯片技术那样需要设计探针，能在全基因组范围内以单碱基分辨率检测和量化转录片段，并可用于研究基因组图谱尚未完成的物种。第二代测序技术已广泛应用到多个生命科学领域，如基因组重测序，基因组结构变异、全基因组分型、miRNAs的挖掘等。转录组测序RNA-seq（RNA sequencing）就是基于深度测序技术的新一代高通量测序技术的代表，已广泛用于挖掘新miRNAs的研究中，不仅可以对miRNAs的遗传变异进行检测，同时也能检测到miRNAs的表达丰度。

2 miRNA的形成及其作用机制

过去20年间最令人惊喜的生物发现之一就是非编码RNA（noncoding RNA），miRNA长约22 nt，属于非蛋白编码的单链RNA，但能调控蛋白编码基因的表达。大多数哺乳动物的miRNA由RNA聚合酶II编码，miRNA被发现于不同的基因组区域：蛋白编码基因的内含子、非编码基因的外显子和内含子和蛋白编码基因的3’端区域。大约1/3哺乳动物的miRNA嵌在蛋白编码基因的内含子上，且具有它们所存在的蛋白编码基因相同的转录模式。根据计算预测发现人类有60%的蛋白编码基因通过mRNA的3’端与miRNA上被称为种子区域的5’端碱基配对受miRNA靶向，配对会抑制靶基因的翻译和降解，从而控制基因表达。成千上百个靶基因会受同一个miRNA调控，同时几个miRNA也可以靶向同一个转录子。几乎所有类型的生物学过程都会被miRNA调控，如发育时间的控制、细胞增殖、胚胎干细胞分化、肢体发育、脂肪沉积、肌细胞生成、血管生成和造血作用、神经发生、脂肪代谢、胰岛素分泌乃至癌症的形成。大多数miRNA家族在脊椎动物中是保守的，所以它们的功能也很好地被遗传下来。然而，也有研究表明在人和黑猩猩中发现了许多在哺乳动物中并不保守的新miRNA，约有10%是物种特异性的。这种类型的研究已拓展到更多物种中，发现了大量的谱系特异性miRNAs和物种特异性miRNAs。这些结论表明，对单个生物体miRNA文库的测序更有利于对保守和新的物种特异性miRNAs进行鉴定和分类。计算方法能有效识别不同植物和动物物种中的保守miRNAs，但是这种方法需要知道完整的基因组序列，若信息不全，物种特异性miRNAs不能被可靠地鉴定，直接对miRNA进行测序是一种描述生物体基因组表达的miRNAs直接且有效的方法。

3 高通量测序技术在猪miRNA功能研究中的应用

猪肉是世界上最广泛的食用肉类。近年来，由于猪和人类在解剖学、生理学、生物化学、病理学和药理学上具有很多相似性，猪被认为是生物医学研究的潜在模型系统。因此，猪可以为人类健康相关的研究提供一个全面系统的了解，如肥胖、糖尿病、癌症、胃溃疡、女性生殖健康、心血管疾病、传染病、器官移植等方面。此外，猪在进化上比小鼠更接近人类。猪的经济学和生物医学意义促进了猪基因组测序联盟（S wine Genome Sequencing Consortium，http：//www.piggenome.org/）的成立，以破译猪的基因组序列。基因组序列和转录组分析大大提高了我们探索各种生物和生物医学秘密的能力，从而更好地利用猪的商业性状及有益于人类健康。miRNA和其靶基因的鉴定可以进一步了解影响猪中各种生物和代谢过程的转录后基因调控机制。

对于人和小鼠来说，目前miRBase数据库（http：//www.mirbase.org/）收录的猪miRNA数量并不多，至2014年7月，发现人的前体miRNA数1 181条，成熟miRNA数2 603条；小鼠的前体miRNA数为1 193条，成熟miRNA数1 920条；猪的前体miRNA数为382条，成熟miRNA数为430条。RNA-seq技术已运用在猪的不同组织研究中，如骨骼肌、性腺、肝脏、脂肪组织、子宫内膜上的研究结论使我们对猪的mRNA转录组有了更好的理解。miRNA在β细胞、肌肉细胞个脂肪细胞的代谢转录后调控中起重要作用。通过微阵列芯片技术（Microarray chip technology）对骨骼肌中的整体miRNA丰度进行了检测，用以评价miRNA在猪发育和肉生产中作用。miRNA-seq技术为研究猪miRNA转录组提供了新的视野，尤其是通过Microarray分析未充分检测到的miRNAs。目前为止，通过NGS对猪的肠道、产前和产后的仔猪、发育中的大脑和骨骼肌的miRNA转录组进行了研究。

最近大量研究利用高通量测序方法对猪组织特异性miRNA库进行检测。McDaneld鉴定了猪骨骼肌中的基因表达情况，并预测了可能靶向这些基因的miRNA。Liu等研究氧化型和糖酵解型骨骼肌之间的差异，鉴定了不同肌纤维类型中观察到的表型变异中发挥重要作用的miRNAs。分析了不同猪品种肾脏中表达的miRNAs，鉴定出了品种特异性miRNA，这些miRNAs可能与特定的品种表型有关。此外，猪牙齿中表达的miRNAs已被作为研究牙齿发育分子机制的工具；由于两个物种的相似性，猪肠道中表达的miRNAs可用于研究人类肠道的病理过程。从猪大脑的miRNA表达谱中鉴定了在大脑发育过程中特异性激活的miRNAs。猪胚胎期的睾丸、卵巢和精细细胞的miRNAs表达对了解猪和其他动物胚胎发育过程的调控机制提供了有价值的资源。垂体腺通过特定的激素分泌来维持体内的平衡：有研究表明腺体细胞能产生很多参与这个器官的发育和生理学过程的miRNA。Li等人在猪的肌肉和脂肪组织的比较研究中发现，两种组织中检测到的miRNA组成和表达水平存在巨大差异，说明皮下脂肪发育的基础是由一个复杂的调控网络来实现。表观遗传因子（如miRNA、lncRNA和DNA甲基化）可以调节基因的表达，是骨骼肌发育、代谢和其他过程的关键调节剂。已有研究对猪骨骼肌中miRNA和lncRNAs做了全基因组分析，以研究猪骨骼肌的表型变异，并鉴定出了与肌肉发育相关的几种miRNA和lncRNA，如miRNA-1、m i R N A-2 0 6、m i R N A-1 3 3、miRNA-155、miRNA-127、miRNA-148a、Malat1和H19。

4 高通量测序技术存在的问题及其展望

高通量测序技术近年来在生命科学领域发展的相当迅速，特别是给基因组学的研究带来了许多方向和思路，尽管如此，高通量测序技术依然存在一些不容忽视的局限性。第一，高通量测序技术只适合大规模的测序，其昂贵的实验费用对于一些小型简单的测序来说并不合理，且一般的小型实验室也无法承受。第二，高通量测序后得到的数据量很大，后续的分析工作也是个难点。第三，高通量测序获得的结果仅仅只是研究工作的开始，能用来说明生物学机制的数据还很有限，目前还只是初步获得了基因组信息，其遗传机制和通路还有待进一步研究。

高通量测序技术的出现促进了基因组学研究领域的发展，目前已成为猪转录组研究的重要手段，为猪的基因组学研究提供了一个高效的平台，为当前猪品种遗传改良、辅助育种选择工作提供了数据基础。

略，若有需要请与作者联系

2017-02-21）

宁乡花猪基础研究（5026401-0315069）

许栋（1990.8-），女，汉，湖南岳阳人，博士在读，就读于湖南农业大学动物科学技术学院动物遗传育种与繁殖专业，猪的分子遗传，E-mail：112668472@qq.com