斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白的原核表达与纯化研究

2017-01-16

中国畜牧兽医文摘 2017年12期

（斯澳生物科技（苏州）有限公司，江苏苏州 215123）

作为我国海水养殖产业中的重要品种之一，神经坏死病毒是导致其死亡的主要原因之一[1]。目前临床上尚未研究出治疗这种病毒的药物，因此通过疫苗进行防治是降低斜带石斑鱼死亡率的基本途径[2]。为了实现上述目的，本文以大肠杆菌为载体，对斜带石斑鱼神经坏死病毒（OGNNV）主衣壳蛋白（MCP）基因进行融合[3]，现将整个融合表达流程分析如下：

1 材料与方法

1.1 材料

①表达受体菌株。本研究采用BL21作为分析OGNNV MCP原核表达及纯化过程的菌株，获取途径为购买。②重组质粒。选用pET32a-MCP作为基因融合实验的重组质粒，获取方式为实验室构建。③试剂。本研究试剂主要包含IPTG、抗狼鲈神经坏死病毒单克隆抗体hc3、LA培养基以及相关分析纯。

1.2 方法

1.2.1 原核重组菌获取方法

按照规范实验流程构建重组表达载体，将其转化大肠杆菌BL21感受态细胞。上述流程完成后，于第2d于转化LA平板中选取新长出单菌落，即获得含有斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白基因的原核重组菌（BL21）。

1.2.2 融合蛋白表达方法

从转化平板中新生的阳性菌落中选取一株，将其置入LA液体培养基中。保持实验室室温稳定在37℃左右，将阳性菌落活化过夜。第2d以1%（V/V）比例将LA培养基中的阳性菌落再次转接于新鲜LA培养基中。当阳性菌A600的培养标准达到0.6～1.0范畴时，向LA培养基中加入100mmol/L IPTG，此时，LA液体培养基中的浓度将达到1mmol/L，根据阳性菌落的生长状况培养2-3h。

1.2.3 SDS-PAGE分析方法

培养成功后，取1mL菌液，以12000r/min的转速对菌液进行离心处理。离心时间为1min。离心完成后，收集离心后的菌体，开展SDS-PAGE分析。

1.2.4 鉴定方法

参照《Western-blot kit》《分子克隆实验指南》中的方法规定，对电泳后转移到硝酸纤维素膜中的SDS-PAGE蛋白进行鉴定分析。

1.2.5 可溶性分析方法

参照规范流程对重组菌BL21进行诱导，快速促使其表达。经离心处理后，收集表达后的BL21菌体。混入适量1XPBS，促使沉淀菌体重悬。对菌体进行冰浴处理后，借助超声波设备使得BL21菌液变为澄清状态。取1ml菌液，于4℃温度下12000rpm持续离心10min，取离心后上清液、沉淀逐一开展SDS-PAGE分析。

1.2.6 纯化方法

在正式进行纯化处理前，需按照《分子克隆实验指南》中包含体粗提、洗涤的规定，进行相应处理。于PBS缓冲液中加入适量浓度为8mol/L的尿素，将经过洗涤处理后的包涵体浸入PBS缓冲液中，进行溶解。利用Ni-NTA-Agarose柱对融合蛋白进行层析纯化。将融合蛋白置入透析液中，持续透析36～48h，最终取10μl开展SD-PAGE分析。

2 结果

2.1 鉴定结果

融合蛋白的鉴定结果显示，Westerm-blot及SDS-PAGE中均包含一条特意性表达带，且其位置均位于55.3 kDa区域。斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白基因编码的氨基酸序列相对分子量（理论值）为37 kDa，由于其原核表达过程与一段多肽与目基因发生融合，因此所得融合蛋白分子量为上述两种基因的分子量之和，为55.3 kDa。这两种鉴定方法均证实：重组菌中，OGNNV MCP基因可正确表达。