胚胎干细胞向体表外胚层及角膜上皮细胞分化过程中信号通路的调节

侯璐璐，黄一飞

（1.解放军总医院眼科，北京 100853；2.吉林大学第一医院眼科中心，吉林长春 130021）

胚胎干细胞向体表外胚层及角膜上皮细胞分化过程中信号通路的调节

侯璐璐1，2，黄一飞1

（1.解放军总医院眼科，北京 100853；2.吉林大学第一医院眼科中心，吉林长春 130021）

干细胞泛指体外具有自我更新和多向或定向分化潜能的细胞，胚胎干细胞则可被诱导分化形成内胚层、中胚层及外胚层来源的200余种不同细胞。角膜上皮细胞来源于胚胎发育时期的表皮外胚层。临床上严重、广泛的眼表损伤，需要具有增殖能力的角膜上皮细胞修复损伤。利用体内外研究体系模拟体内胚胎发育及组织环境，阐明具有生物活性的角膜上皮细胞的发育过程，为再生医学提供依据，是近年来研究的热点之一。本文介绍了Notch、Wnt、骨形态发生蛋白及成纤维生长因子等调控表皮外胚层发育及与角膜上皮细胞分化相关的信号通路，以既往实验研究为基础，就各信号通路调控的机制及主要调控因子进行综述。

胚胎干细胞；外胚层；角膜上皮细胞；信号通路

干细胞泛指具有自我更新能力或多向及定向分化潜能的细胞［1］。干细胞按照分化阶段分为胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESC）及成体干细胞。ESC是来源于早期胚胎阶段未分化的内细胞团中的干细胞，属于全能干细胞，可分化形成内胚层、中胚层、外胚层，在体外经不同条件的诱导分化，可发育成为人体的220种细胞。成体干细胞是存在于已分化组织中的未分化细胞，此类细胞能自我更新，定向分化成为组成该组织的细胞。在有机体整个生命过程中，都可通过成体干细胞实现该类型损伤组织器官的修复或替代［2］。

早期ESC领域相关实验多以小鼠ESC作为研究对象，种属差异性限制了研究结果在临床的应用。近年来，以再生医学为基础，诱导人ESC向内胚层、中胚层、外胚层分化的相关研究逐渐增多，为临床疾病的治疗提供了一定的指导。

基于人ESC的实验研究发现，Wnt3a与激活素A（activin A）共同作用，可促进人ESC向限定性内胚层细胞分化［3］，高水平的激活素/Nodal信号通路可有效诱导小鼠ESC向内胚层方向分化。通过上调小鼠血管内皮细胞生长因子受体2/Flk-1及血小板衍生生长因子受体通路，可诱导ESC向中胚层细胞分化，形成造血细胞、血管、心肌和骨骼肌等组织结构［4］。外胚层由神经外胚层及表皮外胚层共同组成。神经外胚层可分化为神经板，进一步分化为中枢和周围神经系统及视网膜。以人ESC为研究对象，利用γ-分泌酶抑制剂DAPT，Wnt抑制剂IWR1e，Hedgehog信号通路激动剂SAG，肝糖原合成激酶3β受体选择性抑制剂CHIR99021和Rho相关卷曲蛋白形成丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（Rho associated coiled protein serine threonine protein kinase，ROCK）特异性抑制剂Y-27632等小分子化合物，通过抑制Wnt，Notch，转化生长因子β（trans⁃forming growth factor-β，TGF-β）和ROCK等信号通路，诱导形成视杯及分层视网膜结构也有相关报道［5］。但诱导ESC向体表外胚层器官分化，特别是向角膜上皮样细胞方向分化，却鲜有文献报道。这可能是由于角膜上皮出现于胚胎发育晚期，分化发育机制复杂，涉及信号通路较多，相关信号通路具体调节机制目前尚不明确。

角膜上皮细胞来源于第5～6周胚胎的表皮外胚层。人胚9 mm时，晶状体泡从体表外胚层完全分离出来，晶状体泡表面的上皮相互融合，形成了一层立方状的上皮，其后分化成为角膜上皮。随着胚胎不断发育，胚眼也不断发育完善，角膜上皮细胞逐步分化，形成完整的各层结构。

角膜上皮细胞在发育过程中受到多种调控因素的共同调节，主要涉及的信号通路包括Notch信号通路、Wnt信号通路、骨形态发生蛋白（bone mor⁃phogenetic protein，BMP）信号通路和碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，b-FGF）信号通路等。一些基因如pax6和p63等在角膜上皮细胞的发育过程中也发挥重要作用。

1 Notch信号通路与表皮外胚层及角膜上皮细胞发育的关系

1.1 Notch信号通路

Notch信号通路调节细胞发育过程中众多细胞程序［6］，是决定细胞分化命运的重要通路。Notch在无脊椎动物和脊椎动物中都有表达，家族成员结构具有高度保守性［7］，调节包括干细胞在内的多种细胞的分化、增殖及凋亡，同时也参与调控细胞黏附和迁移等细胞间相互作用［8-10］，最终影响形态发生及组织器官形成。Notch基因最初是在果蝇体内发现的，其部分功能缺失可导致果蝇翅缘出现缺口，因而得名。Notch受体为相对分子质量约30 000的Ⅰ型膜蛋白，在啮齿类动物和人中分为4种［11-13］，其中Notch1和Notch2在结构上具有高度同源性，Notch3和Notch4在细胞内和细胞外结构域上与Notch1和Notcht2不同。Notch配体也为Ⅰ型跨膜蛋白，在哺乳动物中，其配体包括Delta样分子、Jagged样分子。Delta1，Jagged1和Jag⁃ged2是Notch1-3受体的特异性配体［14-15］。经典的Notch信号通路也称为C启动子结合因子-1/重组信号结合蛋白Jκ（C-promoter binding factor-1/re⁃combination signal binding protein-Jκ，CBF-1/ RBP-Jκ）依赖途径［1］。CBF-1/RBP-Jκ本身为转录抑制因子，Notch信号通路激活后与CBF-1/RBP-Jκ结合，激活下游基因的转录。

1.2 Notch信号通路调节体表外胚层及角膜上皮细胞的发育分化

在体表外胚层分化形成角化细胞的过程中，Notch信号通路是关键的诱导分化因素［17］。在小鼠ESC及人ESC体外培养实验中，Notch信号通路先于p63基因在外胚层祖细胞表达前被激活［18］。p63基因在具有高度增生能力的上皮细胞中高度表达，如干细胞缺乏p63基因,其增殖能力会明显下降。p63基因先于K14表达于外胚层发育过程中，也是复层上皮细胞得以不断增殖的关键基因和重要决定因素［19］。无论是人还是小鼠ESC，在基因水平上抑制Notch信号通路，会提高外胚层发育过程中p63基因的表达水平。通过BMP-4及血清诱导ESC向表皮外胚层、角化细胞方向分化，检测p63的表达水平可发现，p63先于K14表达于诱导分化过程中。同时，在表皮发育过程中，Notch信号通路被抑制，这种抑制保证了体表外胚层发育过程中p63的表达。通过抑制Notch信号通路，可诱导p63的表达，同时激活BMP-4信号通路，后者与表达水平上调的p63协同作用，诱导小鼠ESC向角化细胞方向分化。相反，如激活Notch信号通路，则会抑制p63表达。外胚层祖细胞中p63表达受抑制，则会诱导细胞最终分化成为肌肉、神经或肝细胞。在探究Notch信号通路对角膜上皮细胞分化与增殖影响的研究中，分别抑制和激活Notch通路的表达后，使用免疫荧光标记Notch1，Notch2，Delta1以及Jag⁃ged1，同时检测其基因和蛋白表达；通过检测Ki67和CK3的表达，印证了角膜上皮细胞的分化与增殖与Notch信号通路的关系。当γ-分泌酶抑制Notch信号通路后，Notch1和Notch2表达下调，引起Ki67表达减少和CK3表达上升；通过Jagged1激活Notch信号通路则可上调Notch1和Notch2活性蛋白的表达，同时上调了Ki67表达，下调了CK3的表达。在3D培养体系中，γ-分泌酶不会对Ki67和CI3表达产生影响，Jagged1却仍能引起CK3表达的下调。该研究说明，抑制Notch信号通路可抑制上皮细胞增殖，促进向终末角膜上皮细胞的分化；激活Notch信号通路则会促进上皮细胞增殖，但却抑制了向终末上皮细胞方向的分化［20］。有文献报道，在小鼠角膜上皮细胞发育过程中，Notch信号通路的激活与其增殖水平呈现负相关趋势。该实验研究还证实，中央区角膜上皮细胞Notch信号通路要比角膜缘处活跃，这就进一步说明和角膜缘区相比，中央区角膜上皮细胞具有更强的持续分化能力，但增殖能力稍弱［21］。另一项探究Notch通路激活后对角膜上皮细胞增殖及角膜创伤修复的实验，利用过度表达激活Notch1信号〔Notch的活化形式，Notch细胞内结构域（Notch intracellular domain，NICD）〕的转基因小鼠。结果证实，该转基因小鼠角膜上皮细胞的发育分化与野生型相比并无显著差异，但NICD表达却可促进损伤角膜上皮的愈合，NICD的过度表达改变了损伤后角膜上皮细胞增殖修复的动力学。在野生型小鼠中，角膜上皮细胞损伤后Notch1的表达明显激活上调，同时伴角膜上皮细胞增殖能力的增强［22］。在角膜上皮细胞损伤修复的过程中，通过DAPT或shRNA抑制Notch信号通路的表达则能增强细胞的迁移能力［23］。

在不同的实验设计中，Notch信号通路都对角膜上皮细胞的分化和增殖具有不同程度的影响［20-23］。在胚胎发育过程和角膜上皮细胞损伤修复过程中，Notch通路对角膜上皮细胞增殖和分化的影响并不完全相同，推测这种差异的出现，可能是由于角膜上皮细胞损伤修复过程与角膜上皮细胞胚胎发育过程并不完全相同。在胚胎发育过程不同阶段，Notch信号通路可能对角膜上皮细胞的发育产生不同的影响，其确切的作用机制需进一步研究验证。

2 Wnt信号通路与表皮外胚层及角膜上皮细胞分化的关系

2.1 Wnt信号通路

Wnt信号通路最初于1982年发现于乳腺癌小鼠中，此基因激活依赖小鼠乳腺癌相关病毒基因的插入。随后研究发现，Wnt基因编码的Wnt蛋白可启动细胞内信号传递转导途径，产生生长刺激信号，参与不同的发育过程如细胞分化、细胞移行以及决定细胞命运的增殖等。即Wnt信号通路组成繁杂，形成复杂的信号网络。目前研究认为，Wnt信号通路至少包括3个分支，即Wnt（Wnt/β-环联蛋白）、Wnt/PCP-JNK和Wnt/Ca2+通路［24］。经典的Wnt/β-环联蛋白信号通路激活细胞核内靶细胞的表达。Wnt蛋白通过分泌型卷曲相关蛋白家族（se⁃creted frizzled-related proteins family，SFRP）结合后的一系列反应，触发细胞内的信号转导，引起β-环联蛋白在胞浆中聚集，入核后引发级联反应过程。TCF4是众多调控Wnt/β-环联蛋白信号通路的转录因子中的一种，β-环联蛋白浓度的增加可抑制ESC向三胚层分化，维持其干细胞特性［24］。因此，Wnt信号通路与角膜上皮干细胞以及角膜缘干细胞具有密切的关系。

2.2 Wnt信号通路调节体表外胚层及角膜上皮细胞的发育分化

转录因子4（transcription factor 4，TCF4）作为Wnt信号通路中一个重要的转录调控因子，在维持干细胞特性的过程中具有十分重要的作用。近期一项实验研究表明，TCF4主要表达于角膜缘上皮细胞的基底膜层，角膜上皮干细胞也集中表达于此区域。三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G亚家族成员2（ATP-binding cassette sub-family G member 2， ABCG2）和p63作为角膜上皮干/祖细胞的重要标志物，与TCF4的表达具有很强的相关性。以上实验结果进一步表明Wnt信号通路在角膜上皮发育，尤其是角膜上皮干细胞及祖细胞分化发育过程中，发挥重要的调控作用［24］。另一项关于Wnt/β-环联蛋白信号通路调节角膜上皮干细胞、祖细胞分化的实验证实，Wnt2，Wnt6，Wnt11，Wnt16b和其他4种Wnt抑制物特异性地表达于角膜缘区域，而Wnt3，Wnt7a，Wnt7b以及Wnt10a在角膜中央区上皮高度表达。Wnt/β-环联蛋白信号通路的激活可上调角膜上皮干细胞、祖细胞的增殖能力，使其祖细胞标记ΔNp63α表达上调，而角膜分化成熟的标志性标记物K12表达下调［25］。TCF4与β-环联蛋白结合，作用于Wnt信号通路的某些基因如存活蛋白（survivin），调控细胞功能。存活蛋白基因的表达已被证实与细胞的“干细胞”特性密切相关，因此三者在角膜上皮祖细胞中高表达证明TCF4对于维持人角膜上皮祖细胞的增殖能力具有重要的作用［26］。在角膜上皮细胞分化发育过程中，Wnt信号通路也是小分子化合物作用的重要靶点。Wnt抑制剂小分子化合物IWR1e，可诱导人ESC向神经外胚层方向分化，形成具有视杯样结构及复层视网膜结构的组织［5］。另一种Wnt信号通路抑制剂小分子化合物IWP-2，通过选择性抑制Porcn介导的Wnt棕榈酰化作用，抑制Wnt信号通路及其分泌。IWP-2一般不影响Wnt/β-环联蛋白信号通路，也不影响对Wnt信号刺激的细胞反应，具有抑制向神经外胚层方向分化，并增加向表皮外胚层方向分化的细胞比例的作用［27］。有文献报道，利用IWP-2结合其他小分子化合物，可诱导人ESC来源的多能干细胞向角膜上皮样细胞方向分化［28］。

研究表明，Wnt信号通路的激活可促进角膜上皮干细胞及祖细胞的增殖和分化，其后抑制Wnt信号通路中某些调控位点，则可抑制其向神经外胚层分化，促进其向表皮外胚层及角膜上皮细胞方向分化。抑制不同的信号通路作用位点会产生不同的诱导作用。

3 BMP信号通路在表皮外胚层及角膜上皮细胞分化发育中的作用

3.1 BMP信号通路

BMP是TGF-β超家族的成员。BMP最早发现于骨骼系统的发育形成过程中。TGF超家族整合了TGF-β和BMP信号通路，以及Nodal和存活蛋白配体的信号转导，最终通过Smad家族，整合至Smad4分子上。BMP可作为分泌信号，调节外胚层顶嵴功能，与机体整个发育过程密切相关［29］。BMP有2类受体，Ⅰ型受体包括BMPRIA（ALK3），BMPRIB（ALK6）和ActRL（ALK2，ALK1和ALK8），对细胞内信号转导起决定作用；Ⅱ型受体包括BMPRⅡ，ActRⅡA和ActRⅡB。TGF-β/BMP信号转导的实现包括其与受体的膜外结构域结合以及丝氨酸/苏氨酸激酶的激活。

3.2 BMP信号通路调节体表外胚层及角膜上皮细胞的发育分化

目前研究发现，BMP信号通路在神经诱导、神经发生两阶段均发挥重要的作用。它通过激活SMAD家族的转录因子转导其信号通路，并激活一系列下游基因来发挥作用，同时，BMP信号通路在许多层次上受到其他信号通路及信号的调节［30］。在胚胎发育过程中，Wnt，FGF和BMP联合可诱导单层上皮细胞形成［31］。有研究表明，小鼠ESC中，BMP-4是向外胚层分化的一个重要诱导剂［32］。BMP信号通路在早期外胚层发育选择过程中起到重要作用［33-35］。角膜上皮细胞来源于第5～6周胚胎表皮外胚层，此时晶体泡从体表外胚层完全分离出来，晶体泡表面的上皮相互融合，形成了一层立方状上皮，随后即分化成为角膜上皮细胞。在组织学发育上，晶体、嗅上皮及部分颅神经神经节来源于外胚层前胚板。利用人ESC的研究发现，BMP信号通路在胚胎发育早期的激活对于外胚层前胚板的形成起到短暂但却不可替代的作用［32］。之前对小鼠ESC的研究表明，BMP信号通路在上皮发育过程中是不可或缺的关键诱导因子［36］。最近，BMP-4已被证实可利用小鼠ESC诱导分化形成角化细胞［37］，同时通过向Smad4培养体系中加入维甲酸处理后，神经外胚层基因表达量明显降低。也有文献称，BMP-4在外胚层发育通路中可诱导神经前体细胞凋亡［36］。BMP-4通过调节miR-23a/24-2/ 27a与Smad5的结合，可抑制小鼠ESC向表皮外胚层干细胞分化过程中的细胞凋亡［38］。一项以人ESC为研究对象的实验结果提示，在胚胎发育过程中加入BMP，可阻断胚胎向神经细胞方向分化，诱导其向表皮方向发生。BMP通过Smad信号通路，调节AP2γ的表达。而AP2γ的过度表达可抑制向神经外胚层方向分化，促进向表皮外胚层方向分化［39］。

BMP信号通路在调节胚胎发育分化过程中起到了重要的作用，在调节外胚层方向分化过程中，激活BMP信号通路可以抑制其向神经上皮方向的分化，增加表皮外胚层分化的比例，结合其他诱导剂或小分子化合物，则可进一步诱导向角膜上皮细胞方向的分化发育。

4 FGF信号通路在表皮外胚层及角膜上皮分化发育中的作用

4.1 FGF信号通路

FGF属于生长因子家族。在血管形成、伤口愈合、胚胎发育及其他多种内分泌信号通路中起到重要调控作用。在哺乳动物早期胚胎发育过程中，FGF-4是最早表达的因子。在四细胞时期、原肠胚时期、卵原筒阶段以及原条形成过程中，FGF-4都发挥重要作用［40］。FGF对干细胞自我更新发挥重要的调控作用，其信号通路在外胚层的发育过程中也发挥重要作用。多数文献报道称，FGF在中枢神经系统及外周神经系统发育中发挥重要的诱导作用［41］。在角膜分化发育过程中，FGF-7和FGF-10由角膜间充质细胞分泌，它们与分布于角膜缘和中央区角膜上皮细胞的FGF受体2（FGF receptor 2，FGFR2）结合，参与角膜缘干细胞的增殖，调节角膜上皮细胞的自我更新与代谢［42-44］。

4.2 FGF信号通路调节体表外胚层及角膜上皮细胞的发育分化

表皮外胚层是外胚层一个重要的分化发育方向。在表皮外胚层来源的组织器官中，大量分布FGF及其各种受体，但关于该信号通路如何精确作用，诱导向表皮方向分化发育的文献较少［45］。既往曾有研究显示，在皮肤附器的发育过程中，FGF-10起到重要的调控作用［46］。最近研究发现，培养人ESC来源的多能干细胞系，利用b-FGF结合2种小分子化合物，可诱导多能干细胞向角膜上皮细胞样方向分化。该实验中，在无血清及无滋养层细胞条件下，利用上述诱导分子，可下调干细胞相关基因表达，上调角膜发育过程中的重要调控因子如p63和pax6等，同时先后上调K14和K12的表达水平，获得角膜上皮样细胞［5］。利用具有fgfr2缺陷的基因敲除小鼠fgfr2CKO，观察其胚胎发育可以得知，其角膜上皮层与基质层与野生型相比，明显变薄。在胚胎发育的晚期阶段，fgfr2CKO小鼠角膜上皮及基质层无标志性基因K12的表达。pax6在胚胎E12.5有表达，随后在E16.5表达消失，说明FGFR2在维持pax6的持续表达中具有重要的作用，而且FGFR2的表达不依赖于ERK1/2信号通路［47］。

结合以上研究结果，FGF信号通路激活后可诱导干细胞向角膜上皮细胞方向分化，表达终末角膜标志性基因K12，同时可促进角膜上皮发育过程中重要调控因子pax6的表达。

5 其他信号通路在表皮外胚层及角膜上皮细胞分化发育中的作用

除上述4种主要信号通路外，其他信号通路也在一定程度上影响到ESC向角膜上皮样细胞方向分化发育。Noggin就是其中一种比较重要的信号通路。Noggin也叫头蛋白，是一种分泌型多肽，由NOG基因编码，与BMP4相同，都属于TGF-β超家族成员。Noggin是BMP信号通路的拮抗剂，通过抑制BMP信号通路转导，来调节干细胞向外胚层、表皮外胚层以及向角膜上皮样细胞方向的分化。hedgehog信号通路在角膜上皮分化发育过程中也具有重要的作用。在哺乳动物和鸟类中，hedgehog具有3种配体，分别是Dhh（desert hedgehog），Ihh（Indian hedgehog）和Shh（sonic hedgehog），这些信号通路中的调控蛋白的作用具有浓度依赖性，调控胚胎角膜上皮细胞分化发育、成体角膜缘干细胞特性维持等多种过程［48］。Shh信号通路在角膜上皮细胞中表达，外源性Shh信号在调控角膜上皮迁移的过程中具有Pax6浓度依赖性，而在调控角膜上皮细胞增殖过程中则与Pax6浓度无关［49］。同时，hedgehog信号通路在调节晶体发育及晶体上皮细胞的增殖、存活过程中起至关重要的作用，角膜上皮细胞发育缺陷多继发于晶体迁移移行过程中的缺陷［50］。

6 结语

尽管角膜组织结构简单，组成有序，但角膜的胚胎分化发育过程至今仍未完全明了。Notch，Wnt，BMP和β-FGF等信号通路都对干细胞向角膜上皮样细胞的分化具有一定程度的影响。但目前尚无成熟方法诱导干细胞形成角膜上皮样细胞。如能进一步了解角膜上皮细胞的分化发育过程，明确其发育过程中信号通路的调节，在体外通过寻找已有的或通过人工合成药物或小分子化合物，作用于不同时期、不同信号通路，激动或抑制某些关键调控因子的作用，以达到模拟正常胚胎发育过程的效果，使其分化形成角膜上皮样细胞。将获得的角膜上皮样细胞及相关药物和小分子化合物应用于临床，治疗眼表广泛损伤患者，具有广阔的临床应用前景。

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Signaling pathways inducing embryonic stem cells to differentiate into epidermal and corneal epithelial cells

HOU Lu-lu1,2,HUANG Yi-fei1
(1.Department of Ophthalmology,General Hospital of PLA,Beijing 100853,China;2.Department of Ophthalmology,the First Hospital of Jilin University,Changchun 130021,China)

Stem cells are a group of self-renewal cells with the potential to differentiate into a variety of cell lineages.Embryonic stem cells can differentiate into more than 200 types of cell lineages belongingto endodermal,mesodermal and ectodermal tissues.Corneal epithelial cells derive from epidermal ectoderm during embryonic development.When the ocular surface is severely damaged,corneal epithelium with proliferation potential is essential for its reconstruction.Recent studies are focused on differentiation of bioactive corneal epithelial cells.This review summarizes signaling pathways including Notch,Wnt,bone morphogenetc protein or fibroblast growth factor pathways that are involved in regu⁃lating the development of embryonic ectoderm and corneal epithelial cells revealed in previous studies.

embryonic stem cells;ectoderm;corneal epithelial cell;signaling pathway

HUANG Yi-fei,E-mail:huangyf301@gmail.com

R966

A

1000-3002-（2017）02-0195-08

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.02.11

Foundation item:The project supported by National Basic Research Program of China(973 Program)(2013CB967001); and National Natural Science Foundation of China(31271059);and National Natural Science Foundation of China (81670830)

2016-06-09 接受日期：2017-02-08）

（本文编辑：齐春会）

国家973重点基础研究发展计划（2013CB967001）；国家自然科学基金（31271059）；国家自然科学基金（81670830）作者简介：侯璐璐，女，医学硕士，主要从事角膜病临床治疗研究；E-mail：houluraul7@163.com；黄一飞，男，博士，主任医师，教授，主要从事角膜病和眼外伤等临床治疗研究。

黄一飞，E-mail：huangyf301@gmail.com