LAMP技术研究进展及其在动物疫病检测中的应用

徐淑菲，孔繁德，苗 丽，蔡振鸿，林振基，赵 冉

（1. 厦门出入境检验检疫局，福建厦门 361026；2. 河南出入境检验检疫局，河南郑州 450003；3. 厦门市思明区市政管理中心，福建厦门 361010；4. 厦门市农产品质量安全检验测试中心，福建厦门 361000）

LAMP技术研究进展及其在动物疫病检测中的应用

徐淑菲1，孔繁德1，苗 丽2，蔡振鸿3，林振基1，赵 冉4

（1. 厦门出入境检验检疫局，福建厦门 361026；2. 河南出入境检验检疫局，河南郑州 450003；3. 厦门市思明区市政管理中心，福建厦门 361010；4. 厦门市农产品质量安全检验测试中心，福建厦门 361000）

本文从技术原理、研究进展及在动物疫病检测中的应用三个方面对环介导等温扩增（LAMP）技术进行了阐述。与普通PCR、荧光定量PCR相比，LAMP技术具有不需要精密仪器、肉眼即可判定、操作简单、所用时间短、灵敏度高等优点，在水生和陆生动物的细菌病、病毒病、寄生虫病的检测中得到广泛应用。LAMP技术与其他技术的联合应用以及LAMP检测仪器的出现，更加促进了LAMP技术的发展和应用。

环介导等温扩增技术；检测；发展；应用

目前的动物疫病检测方法包括传统的形态学和生化方法、分离鉴定方法、免疫学方法、分子生物学方法、蛋白质指纹图谱分析方法等。随着基因组测序工作的完成，分子生物学方法作为一种快速检测病原菌的手段得到广泛应用，如核酸探针技术、PCR技术、荧光定量PCR方法、生物芯片技术、LAMP技术等。核酸杂交、PCR等方法应用广泛，但在实际运用中，还存在一些难以克服的问题，如假阳性、引物二聚体非特异性扩增，以及片状拖带、涂抹带，等等。

LAMP技术即环介导的等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplifcation，LAMP），因其不需要PCR仪和昂贵的试剂，目前已被广泛应用于肿瘤筛选、植物病毒检测、转基因食品检测、动物胚胎性别鉴定、水生和陆生动物的细菌性及病毒性疫病检测等[1]。

与普通PCR、荧光定量PCR技术相比，LAMP的优点突出：（1）不需要昂贵的精密仪器，恒温状态即可；（2）扩增效率高，能够获得大量扩增产物；（3）具有高特异性；（4）通过添加Loop引物，可以加快反应，缩短一半的时间；（5）因扩增产生大量的副产物焦磷酸镁白色沉淀，肉眼即可观察结果，也可借助于斑点杂交或横向流动试纸条等方法辅助结果检测。

1 LAMP原理

LAMP是2000年由日本研究人员Notomi等发明的一种新型的体外等温扩增特异核酸片段的技术。其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，60～65 ℃恒温扩增，15～60分钟左右即可实现109～1010倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。在DNA合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物（dNTPs）中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色，因此可以把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。

1.1 LAMP引物的设计

基于靶基因3'端的F3c、F2c和Flc区，以及5′端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。

FIP（Forward Inner Primer）：上游内部引物，由F2区和F1c区域组成，F2区与靶基因3′端的F2c区域互补，F1c区与靶基因5′端的Flc区域序列相同。

F3引物：上游外部引物（Forward Outer Primer），由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。

BIP引物：下游内部引物（Backward Inner Primer），由B1c和B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1c域与靶基因5’端的Blc区域序列相同。

B3引物：下游外部引物（Backward Outer Primer），由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。

1.2 扩增原理

60～65 ℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65 ℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物，依靠一种高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段，即第1阶段为哑铃状模板构造的形成过程，第2阶段为扩增循环延伸阶段。

1.3 环引物的应用

环引物虽不影响反应的特异性，但增强了反应敏感性，并起到加速反应的作用。Loop引物结合到反应中间产物环状物F1、F2（或者B1c、B2c）之间的区域上，通过某种机制，可使反应时间至少缩短一半[2]。

2 LAMP技术的发展

2.1 LAMP检测仪器的发展

随着LAMP技术的发展，相关技术公司逐步研发出相关仪器设备，取代人工肉眼观察或者电泳检测产物，克服肉眼观察或者电泳带来的误差和污染，使结果判定更准确。

LAMP实时浊度仪是日本荣研研发的设备。此装置可以完成从基因扩增到检验的整个过程。LAMP实时浊度仪在等温条件（60～65 ℃）下孵化，通过测定扩增基因时出现的副产物——焦磷酸镁的混浊度，来判断是否存在目标基因，其最大可以同时扩增测定32个样本，并可提前设定Loopamp试剂配套所需的测定条件，实时测定每个样本的浊度，所得结果可在电脑中通过图表显示。此设备可大大减少手动操作产生的气溶胶，减少污染，并可实时监测浊度，提高了准确率。

等温扩增荧光检测系统是一套开放式系统。其以IAT（核酸等温扩增技术）为基础，结合荧光检测技术，在恒温条件下，通过添加双链结合荧光染料，实时监控扩增过程，快速完成核酸扩增；通过实时扩增曲线和产物溶解曲线，判定阴阳性并分析实验结果，无需开盖或其他扩增后处理，可应用于环介导核酸等温扩增技术（LAMP，LOOPLAMP）、滚环扩增技术（RCA）、单引物等温扩增 （SPIA）、交叉引物扩增技术（CPA）等各类型等温扩增反应，也兼容多种荧光指示剂，如生物荧光、荧光染料、钙黄绿素和荧光探针等。此系统有配套核酸检测试剂盒，反应试剂可直接扩增DNA和RNA样本，且RNA样本无需进行逆转录。该系统除可使用配套试剂外，还可使用其他同原理配比试剂。

2.2 LAMP检测技术的发展——荧光LAMP技术

LAMP是一种快速灵敏的检测方法，不需要特定的PCR仪器，其灵敏性可以和PCR相媲美，甚至超越PCR。PCR技术靠加热使双链DNA解链，LAMP技术则是依靠酶的活性。LAMP在链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，引物退火结合到靶序列上并延伸。LAMP反应十分迅速，在Loop引物的加速作用下，最低5 min即可完成反应。

一般的LAMP技术只能进行单一的靶基因检测，限制了LAMP的应用。使用荧光标记或嵌合染料的实时检测方法，以前采用的都是非特异性淬灭。非特异性淬灭降低了实时检测方法的灵敏性，也限制了多重检测技术荧光团的选择。

美国Nathan等[3]研究人员，在LAMP基础上，优化了引物，可进行多重LAMP反应，同时进行多个靶基因（多达4个）的检测。

将FIP（F1c+F2）引物5′标记淬灭基团或荧光基团，另外合成F1c的互补序列Fd；Fd的3′端标记淬灭基团或荧光基团、3′端修饰的Fd退火结合到5′端修饰的FIP序列上，形成Q-FIP/Fd复合引物。F1c片段一般为20～25个碱基，其Tm值大于60 ℃，因此Q-FIP/Fd复合引物仍能在63～65 ℃稳定地退火结合到靶序列上，在没有链置换DNA聚合酶的作用下不会出现荧光信号。在LAMP反应过程中，当BIP引物结合到含有Q-FIP/Fd复合引物的单链DNA模板上进行链扩增反应时，标记荧光基团的Fd引物解离，荧光基团发出的荧光不能被淬灭基团吸收，从而使荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与LAMP产物的形成完全同步。

将等摩尔数的Q-FIP、Fd混合，加热至98 ℃，然后缓慢冷却至室温，就可使Q-FIP、Fd退火结合形成Q-FIP/Fd复合引物。然而，Q-FIP/Fd复合引物完全取代FIP会抑制LAMP扩增反应，等摩尔数的Q-FIP/Fd复合引物、FIP引物混合物将大大减弱Q-FIP/Fd复合引物对扩增的抑制作用。与使用野生型Bst DNA polymerase相比，如果LAMP反应使用Bst 2.0 DNA polymerase或Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase，那么效果会更好。

单重荧光LAMP反应可以推广至多重荧光LAMP反应，总的引物浓度不变。每种多重引物的浓度根据检测模板的数量调整，为1/n（n为荧光LAMP反应的模板数）。在多重荧光LAMP反应中，优先选择荧光信号更强的荧光基团。ROX是荧光信号最强的荧光基团，Cy5、Cy5.5、HEX次之，6-FAM信号较弱，难以和背景荧光信号区分开。

2.3 LAMP检测技术的发展——Stem Primers在LAMP中的应用

LAMP 6条引物的设计，需要选择8个引物位点，每条引物的位点和方向都有限制。为了克服这种局限性，Gandelman等[4]建立了一种替代方法STEM-LAMP，用Stem Primers替代Loop Primers。在反应速度和特异性上，STEM-LAMP和LOOP-LAMP类似，但STEM-LAMP更具优越性、灵活性，体现在：①引物设计区域更广，局限性更小；②Stem primers不会结合到DNA环状区域，无方向性；③可进行多重反应；④没有置换引物也可以完成反应；⑤不仅可以用于定性检测，也可以用于定量检测。而LOOP-LAMP 需要6条引物 ：2条环生成引物（FIP、BIP）、2条链置换引物（F3、B3）、2条加速引物（LoopF、LoopB）。引物设计时需选择靶基因上8段不同的区域，环生成引物（FIP、BIP）、链置换引物（F3、B3）、加速引物（LoopF、LoopB）位置严苛，只能单向与靶基因结合；LoopF、LoopB必须分别在F1、F2和B1、B2之间，才能易形成引物二聚体（一般FIP、BIP的长度大于40 bp，更易形成引物二聚体）。

3 LAMP在疫病检测中的应用

3.1 LAMP在人类疫病检测中的应用

由于LAMP技术的快速特异，其被广泛应用于临床疾病的检测，给患者提供及时有效的医疗方案。此技术已被成功用于放线杆菌、人类疱疹病毒6型、人类疱疹病毒7型、肺炎链球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测和多种分枝杆菌的区别等。

3.2 LAMP在动物疫病检测中的应用

3.2.1 用于细菌的检测。LAMP最 初 被Maruyama[5]应用于检测大肠杆菌O157：H7的stxA2基因，通过原位法检测stx基因，取得了理想的结果。Akemi Yano等[6]2007年建立了检测产肠毒素大肠杆菌LT1、ST1基因的LAMP方法。该方法特异性强，灵敏度高。LT1的检测限量为4 CFU/管，ST1的检测限量为40 CFU/管，比传统的PCR方法敏感性高10倍，是诊断产肠毒素大肠杆菌的简单快速高效的方法。Masashi Okamura等[7]运用LAMP技术建立了沙门菌菌株O9群的鉴定方法，比普通PCR方法灵敏度高1 000倍。ShaoYanchun等[8]建立了同时检测牛奶中沙门菌和志贺氏菌的多重LAMP-RFLP方法，扩增基因分别为invA和ipaH。该方法可根据不同梯形DNA条带和限制性酶切分析，即可鉴别沙门菌和志贺氏菌。还有用于检测产毒素霍乱弧菌、副溶血弧菌、抗青霉素的金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌等的报道。

3.2.2 用于病毒的检测。Anne-Lie Blomstrom等[9]报道了一步法RT-LAMP，检测猪水泡病病毒，其在30～60 min内，即可通过电泳或者肉眼观察结果。Qu等[10]采用LAMP方法检测猪细小病毒，试验结果表明LAMP方法既可应用于猪细小病毒的实验室检测，也可用于养殖场检测。Dukes等[11]2006年建立了检测口蹄疫（FMD）的RTLAMP方法。其与荧光定量PCR相比毫不逊色，适用于野外检测及发展中国家口蹄疫的监控。Chen等[12]建立了检测H9亚型禽流感病毒的RTLAMP方法。该方法比PCR方法灵敏度高10倍，且与其他亚型的禽流感病毒、新城疫病毒无交叉反应。在112份临床样品检测中，RT-LAMP检测出了所有阳性样品，而RT-PCR却有7阳性样品没有被检出。Hang Minh Pham等[13]设计了新城疫病毒的融合蛋白基因的LAMP引物，建立了检测新城疫病毒的RT-LAMP方法。该方法可以直接对分离培养物及临床样品进行检测，其灵敏度和特异性与巢式PCR相当，并具有快速、费用低、简单易操作的优点。

3.2.3 用于动物源性成分的检测。欧洲国家食品法规定，无论是生肉，还是加工产业链中其他产品，都必须贴标签，因此需要一个快速准确的肉品种鉴定方法。Amir Abdulmawjood等[14]建立了检测鸵鸟成分的LAMP方法。该方法的检测限量为1 pg DNA。加工肉类中常含有的盐分、香料、食用油等，虽然会影响PCR的检测，但是不影响LAMP的检测。

3.3 LAMP在水生动物疫病检测中的应用

LAMP是检测鱼类及甲壳类病原的新的技术方法。早期诊断对于水生动物疫病的预防具有重要的作用，而快速检测是预防水生动物疫病的最重要一环。免疫荧光技术（FAT）、酶联免疫吸附技术（ELISA）、分子检测技术（PCR、RFLP、AFLP、RAPD等）已经被用来检测各种水生动物病原。LAMP方法因其较高的特异性、敏感性，在水生动物疫病检测中得到广泛应用。

在水产养殖中，关于迟缓爱德华氏菌、鮰爱德华氏菌、鲶鱼爱德华氏菌、黄鲥鱼诺卡氏菌、白斑综合征病毒、传染性皮下坏死病毒、真鲷虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒等，都有LAMP检测方法的报道，均证实LAMP是一种简单快速灵敏的诊断方法。

Tomoya Kono等[15]将LAMP技术应用于水生动物白斑病的检测，检测限量为1 fg，1 h就可完成病毒检测，但灵敏度比巢式PCR低10倍。对虾白斑综合症病毒（WSSV）和传染性皮下组织和造血器官坏死病毒（IHHNV）为影响世界养虾业的两大重要病毒。He Lin等[16]于2011年建立了同时检测对虾WSSV和IHHNV的多重LAMP方法。根据WSSV的VP28基因和IHHNV的NS1基因分别设计LAMP引物，在FIP的F2、F1c及BIP的B2、B1c的接合处均插入限制性内切酶，其敏感性比巢式PCR高100倍，比普通PCR高1 000倍。Teng等[17]2006年将RT-LAMP和斑点杂交（DBH）两种方法结合，建立了检测桃拉病毒的方法。RT-LAMP反应结束后，采用斑点杂交检测靶基因的信号。该方法简单有效，适用于现场诊断。Gunimaladevi等[18]根据锦鲤疱疹病毒的tk基因，设计4条引物，建立了LAMP方法。其敏感度和PCR相同，检测时间LAMP 60～90 min，而PCR需要3～4 h，LAMP优越性很明显。

3.4 LAMP在寄生虫检测中的应用

以LAMP为基础的检测技术已广泛应用于原生动物寄生虫的检测。Hiroshi Iseki等[19]根据棒状体蛋白1基因设计了同时检测牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫的多重LAMP引物。研究结果表明多重LAMP方法比PCR方法更灵敏。另外，运用LAMP技术检测锥虫、疟原虫、隐孢子虫等动物寄生虫的报道也屡见不鲜。

3.5 GenieII实时荧光等温扩增检测系统的应用

史秀杰等[20]、何俊强等[21]在GenieII实时荧光等温扩增检测系统的基础上，建立了检测传染性鲑鱼贫血症病毒、传染性造血器官坏死病毒的LAMP方法。安元龙等[22]运用GenieII实时荧光等温扩增检测系统，以LAMP法荧光检测为基础，建立了对病毒性出血性败血症病毒进行荧光实时反转录环介导等温扩增检测方法。侯东君等[23]选定一套可在牛羊肉中特异并灵敏的检测出掺杂肉成分的引物对，以动物细胞色素b基因组为模板，可在恒温63 ℃特异性扩增出猪等基因片段而无其他扩增片段影响。

LAMP技术还应用于胚胎性别鉴定、转基因检测等各个检测领域，其在适用性、特异性、敏感性方面均具有优势。

4 结论与展望

从最初2003年LAMP方法的应用到现在，LAMP方法已被成功用于细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原的分子生物学检测和诊断，以及胚胎性别鉴定、转基因检测、各种疫病的检测，等等。LAMP技术本身也在改进和提高，并与其他技术合并应用，如横向流动试纸条法（LFD）、限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）[8]、斑点杂交（DBH）[17]等。LAMP技术多数只能用于检测一个靶目标，但经过研究者们精心的设计和试验，LAMP技术结合限制性酶切分析，可进行双重LAMP检测[16，19]，这推动了LAMP的发展。

在LAMP检测仪器方面，也取得了很大成就，从单纯的检测产物浑浊度的浊度仪到可以进行实时检测的实时荧光等温扩增检测系统，可见研究者们对LAMP方法的认可。在其他辅助条件下（其他方法和仪器），LAMP方法将有更多更广泛的应用。

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（责任编辑：朱迪国）

Research Progress of LAMP Technology and Its Application in Animal Diseases Detection

Xu Shufei1，Kong Fande1，Miao Li2，Cai Zhenhong3，Lin Zhenji1，Zhao Ran4
（1. Xiamen Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Xiamen，Fujian 361026；2. Henan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhengzhou，Henan 450003；3. Xiamen Siming District Municipal Administration Center，Xiamen，Fujian 361010；4. Xiamen Agriculture Product Quality and Safety Test Centre，Xiamen，Fujian 361000）

In this article，the Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）technology was introduced in three aspects：technical principle，research progress and its application in animal diseases detection. Compared with the general PCR and fuorogenic quantitative PCR，the LAMP method has many advantages，including no need of precision instruments，judging results only by naked eyes，easy operation，costing less time and high sensitivity. Based on these advantages，the LAMP has been widely applied to the detection of bacterial，viral and parasitic diseases of aquatic and terrestrial animals. The development and application of LAMP are further facilitated by the combined application between LAMP and other techniques，as well as the emergence of the LAMP detecting instrument.

Loop-mediated isothermal amplifcation（LAMP）；detection；development；application

book=75,ebook=81

S851.3

A

1005-944X（2017）01-0075-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.01.022

国家质检总局科技计划项目（2014IK089）；福建省科技计划引导项目（2015Y0031）；厦门市科技计划项目（3502Z20154079）