大疱性类天疱疮患者疱液中趋化因子受体5和可诱导共刺激分子的检测

姜蔚蔚 朱英华 杨敏 岳宏元 王红梅 杨海琼 焦阳116021大连医科大学（姜蔚蔚、焦阳）；大连市皮肤病医院皮肤科（朱英华、杨敏、岳宏元、王红梅、杨海琼）

·研究报道·

大疱性类天疱疮患者疱液中趋化因子受体5和可诱导共刺激分子的检测

姜蔚蔚 朱英华 杨敏 岳宏元 王红梅 杨海琼 焦阳
116021大连医科大学（姜蔚蔚、焦阳）；大连市皮肤病医院皮肤科（朱英华、杨敏、岳宏元、王红梅、杨海琼）

目的检测C⁃X⁃C趋化因子受体5（CXCR5）和可诱导共刺激分子（ICOS）在大疱性类天疱疮（BP）患者疱液中的水平，探讨其在BP发病机制中的意义。方法收集15例BP患者疱液为实验组，15例Ⅱ度烧伤患者疱液为对照组，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法分别检测CXCR5及ICOS在两组疱液中的水平。结果实验组及对照组疱液中CXCR5水平分别为（219±145.31）、（147±23.83）ng/L，差异有统计学意义（t=4.577，P＜0.05），但疱液中ICOS水平差异无统计学意义［（30.18±14.86）比（21.43±5.32）ng/L，t=1.628，P＞0.05］。结论CXCR5的表达可能与BP发病有一定关系，而ICOS与BP发病的关系尚需进一步研究。

类天疱疮，大疱性；受体，CXCR5；可诱导协同刺激分子；疱液

既往研究证实，辅助性T细胞、调节性T细胞等均参与大疱性类天疱疮（BP）的发病过程［1⁃6］。但自2000年报道了表型为CXCR5+CD40L+ICOS+的T细胞亚群即滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cells，Tfh）［7］以来，其辅助B细胞产生自身抗体、发挥免疫效应的作用在众多自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮（SLE）［8］、干燥综合征［9］等中得到证实，李秋菊［10］和杨敏［11］等分别对Tfh及其相关细胞因子在BP发病机制中的作用进行研究，认为Tfh可能参与BP的发病。我们用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测BP患者疱液中趋化因子受体5（CXCR5）和可诱导协同刺激分子（ICOS）的水平，以期进一步探讨Tfh细胞在BP发病机制中的作用。

一、对象与方法

1.病例与标本：2014年3月至2015年9月大连市皮肤病医院门诊或病房初次就诊，结合临床表现、组织病理及免疫荧光确诊［12］的患者15例，其中男10例，女5例，年龄（70.07±6.71）岁，疱液标本均取自患者新发未感染水疱。对照组为Ⅱ度烫伤患者15例，男10例，女5例，年龄（66.93±6.50）岁，取其水疱疱液。将疱液标本离心（离心半径10 cm，3 000 r/min）5 min后，取上清液，保存于-70℃冰箱中。实验组与对照组之间年龄、性别等资料具有可比性。本实验已通过大连市皮肤病医院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

2.试剂：人CXCR5、ICOS ELISA试剂盒、考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒，均产自上海酶联生物科技有限公司。

3.方法：双抗体夹心ELISA法分别检测实验组和对照组疱液中CXCR5和ICOS的水平，严格按照说明书步骤执行。在450 nm处测吸光度A值，通过绘制标准曲线计算标本中CXCR5、ICOS浓度。考马斯亮蓝法分别对两组疱液中的总蛋白水平进行测定，于比色杯中加入990 μl考马斯亮蓝G250和10 μl样品，放于37 ℃、120 r/min（半径16 mm）空气振荡10 min，然后于紫外可见光分光光度计（Ultrospec 2100 Pro uv/visible Spectrophotometer，美国通用电气公司，General Electric Company，美国）中595 nm波长处进行比色，得到吸光度A值，根据标准曲线计算蛋白浓度。

4.统计学分析：用SPSS16.0软件包进行两独立样本t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

二、结果

1.CXCR5在BP患者疱液中的水平：实验组CXCR5的平均水平为（219±145.31）ng/L，对照组CXCR5的平均水平为（147±23.83）ng/L，差异有统计学意义（t=4.577，P＜0.05）。

2.ICOS在BP患者疱液中的水平：BP患者疱液中ICOS的水平为（30.18±14.86）ng/L，对照组为（21.43±5.32）ng/L，两组间差异无统计学意义（t=1.628，P＞0.05）。

3.疱液中总蛋白水平：实验组中总蛋白水平为（1.09±0.07）×106ng/L，对照组为（9.53±0.84）×105ng/L，差异无统计学意义（t=0.015，P＞0.05）。

三、讨论

Tfh是一种抗原特异性介导初始B细胞及记忆B细胞活化的特殊CD4+T细胞，它存在于次级淋巴器官的B细胞滤泡内［13］。CXCR5是Tfh产生和发展的主要表面标志，也是最容易测量的标记物，滤泡的重新定位是Tfh发展和发挥作用中重要的一步［14］。T细胞的活化及抗原的持续暴露引起CXCR5的表达［8］，所以检测到CXCR5的表达可在一定程度上提示T细胞活化、分化成Tfh细胞，或者抗原持续暴露。ICOS是CD28家族的成员，在Tfh表面高表达，它与抗原提呈细胞表面的配体ICOSL结合并相互作用，对Tfh细胞的产生、维持及发挥作用都重要［15］。

我们的实验显示，CXCR5在BP疱液中的水平显著升高（P＜0.05），提示CXCR5可能与BP发病有一定关系；而ICOS在BP疱液中的水平与对照组比较差异无统计学意义，该结果与我们预想的不一致，分析可能原因如下：一种是ICOS同时存在于正常人的体内及BP患者的疱液中，此细胞因子可能和致病相关，也可能只是上游细胞间反应激发的下游产物或伴随因子，但它们是一种不稳定的小分子蛋白，会随着时间的推移而解构或丢失；另一种可能性是我们的样本量少，不能真实反映ICOS在正常人体液及BP患者疱液中的差异，ICOS与BP发病相关性需扩大样本进行探讨。另外，相对于以往报道的BP患者疱液中多种细胞因子［16］，所测得的ICOS和CXCR5含量相对较低，在疱液中进行此类成分的检查，较为困难，提示在今后的研究中应收集较多的疱液浓缩后再进行实验，可能会提高检出率。

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Detection of C⁃X⁃C chemokine receptor type 5 and inducible costimulator in blister fluid of patients with bullous pemphigoid

Jiang Weiwei,Zhu Yinghua,Yang Min,Yue Hongyuan,Wang Hongmei,Yang Haiqiong,Jiao Yang
Dalian Medical University,Dalian 116021,China（Jiang WW,Jiao Y）;Department of Dermatology,Dalian Dermatosis Hospital,Dalian 116021,China（Zhu YH,Yang M,Yue HY,Wang HM,Yang HQ）

Zhu Yinghua,Email:zyh⁃office@163.com

ObjectiveTo detect levels of C⁃X⁃C chemokine receptor type 5（CXCR5）and inducible costimulator（ICOS）in blister fluid of patients with bullous pemphigoid（BP）,and to explore their significance in the pathogenesis of BP.MethodsBlister fluid samples were collected from 15 patients with BP（experimental group）and 15 patients with second⁃degree burns（control group）.Enzyme⁃linked immunosorbent assay（ELISA）was performed to detect the levels of CXCR5 and ICOS in the 2 groups.ResultsThe level of CXCR5 was significantly higher in the experimental group than in the control group（219±145.31vs.147±23.83 ng/L,t=4.577,P＜0.05）,while no significant difference in the ICOS level was observed between the 2 groups（30.18±14.86vs.21.43±5.32 ng/L,t=1.628,P＞ 0.05）.ConclusionThe expression of CXCR5 may be associated with the occurrence of BP,but further researches are needed to determine the relationship between ICOS and the occurrence of BP.

Pemphigoid,bullous;Receptors,CXCR5;Inducible costimulator;Blister fluid

朱英华，Email：zyh⁃office@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.01.011

2016⁃03⁃17）

（本文编辑：尚淑贤）