牛肠道病毒的病原学特征及检测技术研究进展

庄金秋，梅建国，张 颖，刘吉山，沈志强

（山东省滨州畜牧兽医研究院，滨州 256600）

综述与专论

牛肠道病毒的病原学特征及检测技术研究进展

庄金秋，梅建国，张 颖，刘吉山，沈志强

（山东省滨州畜牧兽医研究院，滨州 256600）

牛肠道病毒（BEV）感染为国内近年来的新发传染病，在牛群中普遍存在，且常与其他病原体发生混合感染和继发感染，导致牛群出现较高的死亡率，给养牛业造成巨大的经济损失。文章概述了牛肠道病毒的病原学特征及检测技术研究进展，以期为预防和控制该疾病提供参考。

牛肠道病毒；病原学；检测；进展

牛肠道病毒感染是由小RNA病毒科肠道病毒属的牛肠道病毒（bovine enterovirus，BEV）引起的一种临床上以发热、咳嗽、呼吸困难、腹泻和繁殖障碍为主要特征的传染病。本病在我国为新发传染病，在牛群中非常普遍，且常与其他病原体发生混合感染和继发感染，导致牛群出现较高的死亡率，给养牛业造成巨大的经济损失。因此，采取有效措施预防和控制BEV感染对于确保养牛业的健康发展非常重要。本文对牛肠道病毒的病原学特征及其检测技术进行了概述，以期为预防和控制此病提供参考。

1 牛肠道病毒的由来和发现

Moll等［1］于 1959 年首次报道了牛肠道病毒（BEV），之后许多国家也陆续报道了本病的暴发与流行情况。2011年李英利等［2］从内蒙古发生腹泻的犊牛体内分离出1株肠道病毒，经分析发现该毒株为F种肠道病毒，进而首次确定了我国存在F型牛肠道病毒感染。彭晓薇等［3］从北京发生严重腹泻的泌乳奶牛中也分离获得了F型肠道病毒。侯佩莉等［4］经过一系列病毒鉴定方法最终从泌乳奶牛的粪便中也分离出一株F型牛肠道病毒。邢泽黎等［5］从发病严重致死的肉牛体内分离得到E型肠道病毒。张海丽等［6］从山西发生严重腹泻的泌乳奶牛中也分离获得E型肠道病毒。BEV多从发生严重呼吸道症状、消化道症状和繁殖系统障碍的病牛体内分离获得。该病在世界各国牛群中较为常见，感染率达17.6%～80.0%。感染此病毒可引起牛下痢和呼吸道症状，食欲下降，严重的还有便血，产奶量大幅下降，给养牛业造成了严重的经济损失。近年来本病的发生与流行有逐渐升高的趋势。

2 病毒的形态及分类地位

牛肠道病毒的病毒粒子外观呈球形、正二十面体、无包膜、大小在25～30 nm之间，其基因组为不分节段的单股正链RNA，全长7.5 kb。根据最新病毒分类，牛肠道病毒与人脊髓灰质炎病毒、人柯萨奇病毒和猪肠道病毒等同属小RNA病毒科肠道病毒属中的成员。该属病毒包括 A、B、C、D、E、F、G、H、J九个肠道病毒种及 A、B、C三个鼻病毒种，其中肠道病毒E和F种属于牛肠道病毒。E 种包括 E1～E4，F 种包括 F1～F6。

3 病毒的流行病学特点

牛肠道病毒感染符合肠道病毒属病毒感染的普遍规律：一种综合征可由不同肠道病毒所引起，同一种（型）肠道病毒可以导致不同综合征；感染肠道病毒后多数为亚临床表现（有超过90%的感染牛无症状），不易被发现；普遍分布于世界各地，感染广泛存在，并且常引起暴发；在环境中非常稳定，能在环境中存活很长时间。牛肠道病毒的病原性并不明显，但由于其有时会侵犯其他器官而导致临床上各种综合征的出现。牛肠道病毒的感染宿主较广，包括牛、羊、马、犬、羊驼等动物。

4 病毒检测技术研究进展

4.1 病毒的分离培养

病毒分离与鉴定是检测BEV感染的金标准，实验室常采用MDBK细胞进行病毒分离试验。采集的样品处理后，接种MDBK细胞培养，观察是否出现细胞病变（CPE），并对其核酸进行测序比对，确定是否存在BEV感染。病毒分离与鉴定是BEV最可靠的检测方法，但其费时长，操作繁琐，技术人员也需要经过长时间的培训。

4.2 血清学检测技术

1989年Zhang等［7］建立了捕获ELISA法来检测血清中的BEV抗体。此法具有敏感性强、特异性高的特点，更重要的是比血清中和试验（SN）更经济。1990年Zhang等［8］又建立了阻断ELISA法检测牛血清中的BEV抗体，该方法与传统SN法相比敏感性高，而且耗时短，可替代传统SN法用于大规模牧场的抗体检测。郭金玉等［9］利用北京某牛场BEV-2型分离毒株的VP1蛋白构建了检测BEV抗体的间接ELISA方法，此法操作比较简单、快速、使用价值比较高。朱彤等［10］通过扩增BEV的VP2基因并进行一系列的转化、诱导表达、纯化出重组蛋白，制备了较高效价的多克隆抗体，为BEV的血清学诊断方法的建立及亚单位疫苗的研制奠定了基础。周萍萍［11］将纯化好的3D蛋白作为包被抗原，建立了BEV-3D-ELISA方法，应用该方法对哈尔滨市送检的425份奶牛血清进行了检测，阳性率高达41.41%。盖小春［12］应用表达纯化的E种肠道病毒HY12 VP2重组蛋白作为包被抗原，建立了检测E种肠道病毒抗体的间接ELISA方法，并对实验感染小鼠抗体消长规律进行了研究，为本病的免疫机理和疫苗研制打下基础。邢泽黎等［13］应用大肠杆菌表达纯化的E种肠道病毒HY12的VP1和VP2重组蛋白制备了抗体，并建立了检测BEV病原的双抗体夹心ELISA方法，对吉林省不同地区的牛群感染BEV进行了病原流行病学调查，发现调查地区牛群的BEV感染率为8.16%～58.70%。双抗体夹心ELISA法检测粪便中的BEV抗原的方法，可以快速、有效地确定牛群是否存在BEV感染，将为新发生BEV感染牛的防控和牛群的净化提供了有效的技术手段。

4.3 分子生物学检测技术

4.3.1 RT-PCR 技术 Jimenez-Clavero等［14］针对 BEV 5′UTR基因建立了RT-PCR方法，并对西班牙多个地区的牛、绵羊、山羊、驴、马以及地表水样进行了检测，结果表明，除了在驴的检测样本中未检测到外，其余均有阳性样本存在。Nathamon 等［15］也根据 5′UTR 基因设计引物建立了RT-PCR方法，并对泰国部分地区的本地牛、印度牛及山羊携带BEV的感染率进行了调查和分析，结果表明，以上几种动物均有BEV的携带，其中本地牛携带率最高，为76%。吴丹等［16］根据口蹄疫病毒（FMDV）和BEV基因的5′UTR保守基因区域分别设计引物，首次建立了同时检测FMDV和BEV的双重RT-PCR快速检测方法，对FMDV的最低检出限为8 TCID50/0.1mL，对BEV的最低检出限为2 TCID50/0.1mL。采用该方法检测了852份临床样品，并与病毒分离方法比较，结果两种方法检测结果完全一致。侯佩莉等［17］针对BEV非结构蛋白3D基因设计引物建立了RT-PCR方法，敏感度高达10-1TCID50。侯佩莉等［18］根椐牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛冠状病毒（BCoV）和BEV基因的保守序列，设计合成引物，在建立单一病毒RT-PCR检测方法的基础上，优化条件，建立了上述3种病毒的多重RT-PCR方法，对24份临床腹泻病料进行了检测，与单项RTPCR的符合率100%。该多重RT-PCR鉴别诊断方法对牛腹泻性疾病病因的确诊、流行病学调查和防控具有重要意义。

4.3.2 实时荧光定量 RT-PCR技术 吴丹等［19］根据5′UTR基因设计引物建立了检测BEV的TaqMan荧光定量RT-PCR方法，对BEV的最小检测量为0.1 TCID50/0.1 mL。对北京周边地区牛群采集的852份临床样本进行了检测，且与分离病毒法进行了敏感性比较，结果表明，该方法检出阳性样本与病毒分离法检出的一致，但敏感性比病毒分离法高10倍。朱彤等［20］根据BEV 3D基因设计引物建立了检测BEV的SYBR Green I荧光定量RTPCR 方法，敏感度达 7.13×101拷贝/μL，是常规 RT-PCR的10倍。应用该方法检测了3个规模化奶牛场送检的41份奶牛腹泻样本和3份气溶胶样本，腹泻样品阳性检出率39.02%（16/41）；3份气溶胶样本均为阳性。说明SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测方法具有特异、稳定、高效的优点，既可以用于临床检测，又可对环境中的BEV进行动态监测，为BEV流行病学调查、诊断提供了有力的技术支持。

5 小结

BEV感染在世界范围内流行，由于其所引起的临床症状与其他病原体（如BVDV、BCoV等）所引起的疾病症状非常相似，仅从临床上进行诊断很容易造成误诊，致使病情加重，甚至威胁到生命安全。能够及早确诊所感染的病毒及类型，对于及时扑灭疫情，控制疫病的传播具有重要作用。目前，我国对牛肠道疾病的诊断和防治还很薄弱，完善该病的诊断技术及研发亚单位疫苗对我国奶牛养殖业具有重大意义。

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《中国草食动物科学》对优秀稿件实行数字优先出版通告

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Progress in the Pathogenic Characteristics of the Bovine Enterovirus and Its Detection Techniques

Zhuang Jinqiu，Mei Jianguo，Zhang Ying，et al
（Binzhou Academy of Animal Scienceamp;Veterinary Medicine，Binzhou 256600，Shandong，China）

Bovine enterovirus（BEV）infection is a new infectious disease.It has been prevalent in the herd in China in recent years，and often has mixed with other pathogens infection and secondary infection.It often results in high mortality of cattle，causes huge economic losses to the cattle industry.In this paper，the research progress in the pathogenic characteristics and detection techniques of bovine enterovirus was summarized in order to provide reference for its prevention and control.

bovine enterovirus；etiology；detection；progress

S852.653

A

2095-3887（2017）06-0049-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.06.014

2017-06-30

山东省重点研发计划项目（2015GSF121027）；山东省现代农业产业技术体系牛产业创新团队项目（SDAIT-09-12）

庄金秋（1978-），女，副研究员，硕士，主要从事细胞培养和动物用病毒疫苗研制工作。