菌影的研究进展及其在猪生产中的应用

邓奇风 陈颀 刘志强

（湖南九鼎动物营养研究院有限公司，湖南长沙410003）

猪病防控

菌影的研究进展及其在猪生产中的应用

邓奇风 陈颀 刘志强*

（湖南九鼎动物营养研究院有限公司，湖南长沙410003）

菌影是细菌在外界因素干扰下，其核酸等内含物流失而形成的空壳。菌影具有细菌完整的细胞膜结构，保留了细菌原有的形态、黏附性和抗原特性，是一种生物安全性高、诱导机体免疫应答效果好的免疫促进剂。本文就菌影的形成机制与制备、使用途径及在猪生产中的应用进行综述，以促进菌影在养猪业的推广应用与研究。

菌影；形成机制；制备；猪；应用

目前，我国养猪业在应对细菌性疾病的预防和治疗中，抗生素仍然是首选药物，这造成了抗生素的滥用。而抗生素滥用可通过抗原抗体反应、肉产品药物残留、粪污排入环境等多种途径导致环境中细菌耐药性普遍增强，使得人类生存环境存在很大的卫生安全隐患。随着抗生素在养猪业的不断限用和整顿，研发能替代抗生素的无毒无残留的绿色药物是养猪业健康可持续发展道路上的重要一环。开发有效的菌苗用以应对细菌性疾病也是抗生素替代或减量使用的一个研究热点，其中菌影（bacterial ghosts,BGS）是通过噬菌体Phi X174的E基因在革兰氏阴性菌中表达，使细胞内外膜融合形成跨膜通道，细胞的渗透压发生改变后其基因组和胞浆等内含物通过跨膜通道流出，剩下的细菌空壳[1-2]。与传统的常规灭活方式制得的灭活菌苗相比，菌影制备的优势在于利用非变性基因灭活，制备的菌影具备细菌的各种抗原成分和免疫黏附分子的特性，有更好的免疫促进功效，还能消除灭活菌苗引发的耐药性和毒性的潜在风险。因此，菌影较传统的灭活菌有更好的免疫效果和更高的生物安全性[3-5]。由于菌影疫苗可发酵进行大量生产，且制成冻干苗可在室温下长期保存，还不需要添加佐剂，这些优势促成了菌影疫苗成为一项研究开发新型基因工程疫苗的平台技术[6-8]。本文对菌影的形成机制、制备方法和使用方法进行简要阐述，并综述了其在猪生产中的应用。

1 菌影的形成机制

目前，菌影的常见制备方法有：基因工程方法、物理方法和化学方法。三种方法共同之处在于以不同机制作用于细胞膜，使膜通透性发生改变，促使胞质内容物排出，但不同方法作用机制不同。笔者认为，化学方法和传统灭活方法具有相似性，化学试剂具有杀菌及残留特征，不太符合菌影生物安全性高的特性，在此不作介绍。目前菌影的形成机制主要分为以下两种。

1.1 噬菌体Phi X174裂解基因E编码蛋白裂解机制

噬菌体Phi X174裂解基因E在限制性温控表达系统λp L/pR-c I857的调控下，当温度超过30℃时，阻遏蛋白c I857的活性急剧下降甚至失活，E基因在抑制因素解除后在细菌细胞内转录翻译，经蛋白质合成得到E蛋白[9]。E蛋白可作用于革兰氏阴性菌细胞膜，实现革兰氏阴性菌内外膜融合，形成特异性跨膜孔道。噬菌体Phi X174裂解基因E编码蛋白裂解机制为：E蛋白整合到内膜后构象发生改变，可能原因是E蛋白在第一次穿膜时卡在膜中的α螺旋结构的第21位脯氨酸残基顺反异构后羧基端易位到细菌的外膜上，从而实现内外膜的融合过程[10]。当膜通透性发生改变后，在高渗透压的作用下，细胞膜吸水胀破，细胞内含物经势能流出细胞外，最后只剩下一个细菌空壳。

1.2 抗菌肽作用机制

抗菌肽（AMPs）是一类广泛存在于自然界生物体中的小肽类物质,它是机体先天性免疫系统的重要组成部分，可人工合成亦可体外诱导表达。抗菌肽对细菌、真菌、寄生虫、病毒、肿瘤细胞等有着广泛的抑制作用。其机制为：抗菌肽在细菌细胞膜上形成某些离子通道，细胞膜随后发生穿孔现象，使细胞内含物流出，最后形成具备细菌的各种抗原成分和免疫黏附分子等特性的空壳细胞。

2 菌影的制备

2.1 基因工程方法

基因工程制备菌影是最经典和常用的方法，主要通过重组质粒、基因重排技术、提高质粒转化技术和电击法等技术来提高菌影的制备效率，以满足疫苗的规模化生产需求。黄春艳等[5]用裂解基因E与PBV220载体构建重组质粒，导入大肠埃希菌O157∶H7，制得该菌菌影，但这一方法的裂解效率低于97%。基因重排技术也是菌影制备的一种基因工程方法，有研究通过基因重排技术对裂解基因E的基因重排制定文库，从中筛选出了一种含E基因突变体的溶菌质粒，然后利用质粒重组技术，导入大肠埃希菌和沙门氏菌内，结果表明两种菌的裂解效率明显提高[11]。Peng等[12]利用pBV-m E质粒成功制备出了肠炎沙门氏菌菌影疫苗。王丽哲等[13]将E基因与SN基因（金黄色葡萄球菌核酸酶A基因，这一基因的功效是能表达出一种蛋白，将DNA分解成小片段）利用柔性氨基酸串联的方法，成功构建出2个串连融合的表达载体，再利用SN基因的特殊功效，菌体裂解率大幅度提升，最高可达99.9%。此外，通过改善溶菌质粒的转化效率有利于提高菌体的裂解率。通过构建穿梭载体，采用接合转化法将质粒融合到传染性胸膜肺炎放线杆菌中，能制出该菌菌影[14]。

对于非工程菌或难以构建合适穿梭载体的细菌，只能通过其他方法将质粒打入受体菌，电转化方法进入了研究工作者的视野。常月红等[15]用裂解基因E与PBV220载体构建重组质粒，利用电击法转入打孔质粒，成功制备了胸膜肺炎放线杆菌的菌影。胡明明等[16]利用电击法将有裂解基因E的重组质粒转入副猪嗜血杆菌，成功制备出副猪嗜血杆菌的菌影。但当碰到有荚膜的细菌或细胞壁较厚的细菌时，电击法的作用发挥便有一定困难。王勇[17]用电转化的方式通过制备鸭疫里默氏杆菌（RA）原生质体，在这一基础上再利用基因重组技术成功制得RA菌影。还有运用多种基因工程方法组合的菌影制备，如刘东胜等[18]把E基因、λp L/pR-c I857和质粒pPBA1100基因进行杂交，再经限制性内切酶和琼脂糖电泳两种鉴定得到阳性重组子，将此阳性重组子转入受体中，通过温度调节便可成功制得多杀性巴氏杆菌的菌影疫苗。

2.2 抗菌肽处理

雷连成等[19]用抗菌肽处理猪胸膜肺炎放线杆菌、枯草杆菌和大肠杆菌O138等菌体来制备细菌菌影，但细菌裂解率低于98%。为了提高对菌体的裂解率，超高压技术与抗菌肽联用被引入菌影的制备。超高压技术是目前广泛应用的冷杀菌技术，其作用于细菌后使细菌的细胞形态结构发生改变，从而使细胞膜破裂或变形，细胞内物质流出。胡本钢[20]运用超高压技术与抗菌肽联用制备出肺炎克雷伯菌和副猪嗜血杆菌的菌影，获得良好的效果，两种细菌裂解率均达到100%。这一方法操作简单易行，不需要载体构建、基因串联表达裂解等复杂的生物工程技术，也能制备出裂解率高的菌影，为菌影疫苗的规模化生产提供了基础研究。笔者认为，利用超高压技术会改变细菌的细胞形态结构，从而造成菌影效果下降，因此，抗菌肽处理技术只能作为制备细菌菌影的补充，可与基因工程法联用。

3 菌影的使用途径

3.1 菌影疫苗

菌影具有完整的细菌细胞膜表面抗原特性，可同时诱导机体的体液、细胞免疫应答及增强黏膜免疫反应，所以可作为疫苗使用。虽然多种革兰氏阴性菌细菌菌影成功的制备方法已有大量报道，但从菌影的制备到疫苗的制备还需要大量的研究工作参与。目前已有幽门螺旋杆菌、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、伤寒沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、李斯特菌、弗氏志贺菌、肠炎沙门氏菌和大肠埃希菌等八种菌影疫苗研究，并成功制出了菌影疫苗[21-24]。其中，只有幽门螺旋杆菌菌影作为疫苗在临床上取得良好的免疫效果[25]。

3.2 载体

目前在菌影上的研究主要集中在菌影疫苗上，但由于菌影独特的形态结构可作为一种有效的运载系统携带外源物质进入机体内，也有关于外源物质的研究，已有研究的外源物质包括亚单位疫苗、核酸和药物等。

外源目标抗原可以锚定在菌影表面，或者通过与外膜蛋白N端或C端结合锚定在菌体细胞膜内[26-27]。已有研究证实，这些锚定作用不会影响插入抗原的正确折叠，可以保持构象表位结构的完整性和酶的活性，还能更好地调控抗原的组装和分类[26]。目前研究较为通透的外源目标抗原锚定方式主要有周质间隙、S层蛋白基质两种。比如，靶抗原载入菌影的周质间隙，可阻止因外环境因素或者冷冻干燥程序引起的抗原降解和失效，从而为抗原产品的制备提供良好的保障。此外，细胞膜表面的S层蛋白基质的六角排列（SbsA）和斜方排列（SbsB）是菌影内壳中片状自行组装的两种结构，可视为天然的载体仓库。

菌影还能作为DNA编码抗原的载体。DNA疫苗是一种新型疫苗，在动物预防与治疗疾病方面发挥着巨大作用，但DNA疫苗的低免疫原性和质粒剂量需求大的特征限制其发展。如果将DNA疫苗（质粒DNA）载入菌影细胞内，利用菌影的靶向性特征，能将DNA疫苗高效、快速地递送到动物指定细胞内并进行抗原的表达[28]。这一过程中经特定筛选的菌影与DNA疫苗存在协同作用，能促进机体免疫反应，克服常规DNA疫苗细胞吸收量少，难以达到足够免疫刺激剂量的缺陷。Wen等[29]用装载HIVgp 140 DNA疫苗的Ty21a沙门氏菌菌影针对性转染小鼠巨噬细胞RAW 264.7时发现，菌影能被有效摄取，且与裸露DNA疫苗相比，这一菌影疫苗免疫小鼠后能引起强烈的全身和局部抗体gp 140抗体的反应。

菌影可作为药物载体，在菌影细胞膜表面，SbsB的p2晶格、SbsA的p6晶格两种晶格都是良好的载体空间，但p6晶格能够插入更多的外源物质[30]。菌影强大的装载能力还能提高局部药物浓度。这一特殊结构促成了菌影作为药物载体能有效减少常规用药中的用药剂量和药物的副作用。同时，菌影作为药物载体有稳定的缓释作用，可使药物对靶细胞作用持久[31]。Paukner等[32]研究表明，溶血性曼氏杆菌菌影装载抗肿瘤药物DOX能靶向性到达人结肠癌细胞，并能将DOX有效缓慢地释放入细胞中，显示出双对数增长的抗细胞毒的增值能力。

4 菌影在猪生产中的应用

菌影的使用途径众多，但在猪生产中的应用研究较少。菌影作为DNA编码抗原载体的研究主体动物一般为小鼠和兔，而现阶段作为药物载体使用的基本方向为人类疾病治疗。目前，菌影作为疫苗或免疫促进剂在猪生产中的应用主要集中在胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌两种致病菌上。

Hensel等[33]在1996年首次描述了APP菌影疫苗对猪的免疫效果，用APP菌影疫苗制成气雾剂对猪只喷洒免疫后，用同型菌攻击免疫猪只均未感染，且从免疫猪只扁桃体、肺脏、肺气泡洗出物中均没有分离到攻毒病株。并在此基础上利用APP菌影建立了猪肺部感染模型。Katinger等[34]对比研究APP菌影和传统灭活株免疫猪群效果，攻毒结果显示，菌影组能完全抵抗因该病原体繁殖所患有的胸膜炎症，而灭活疫苗免疫组保护性明显差于菌影组；测量两组猪只血液中免疫指标显示，灭活疫苗组猪只产生IgG和IgA的抗体水平高于菌影组。但测量猪只支气管肺泡内层液体免疫指标表明，菌影组中IgG、IgA、淋巴细胞和颗粒细胞数量显著提升（＜0.05）。有研究者利用血清5型App制得的APP菌影疫苗对健康易感仔猪接种免疫，免疫后14天攻毒结果显示，菌影组血清中IgG、IL-2、IL-4、IgM、IgA含量均显著（＜0.05）高于对照组；在攻毒过程中还发现，血清5型APP疫苗还能对血清7型APP感染有交叉保护作用[35]。还有研究者应用代表性差异分析和生物信息学两种组合分析方法建立了APP菌影疫苗，并成功构建了免疫接种仔猪前后淋巴细胞基因差异的表达文库，在其中共筛选和鉴定出菌影疫苗免疫接种后的11条上调表达基因。这一成果为研究淋巴细胞对APP菌影疫苗产生的特异性免疫应答机理提供了良好的研究基础，为探究APP菌影疫苗免疫接种仔猪的应答机制贡献巨大。在Hps菌影研究方面，胡明明等利用电击法转入打孔质粒获得Hps菌影疫苗，利用Hps菌影疫苗与Hps灭活疫苗接种幼年猪，攻毒结果表明，菌影组的免疫效果明显优于灭活疫苗组。这一研究成果为Hps新型、高效的菌影疫苗的研制开发和应用提供了基础，同时也为其他菌影疫苗的提供了思路。

此外，菌影在猪生产中的剂量安全及使用方式效果也有相关研究。有研究应用菌影作用于动物口腔、呼吸道黏膜表面，结果显示，在引起免疫应答的剂量范围内，对动物无不良反应。将菌影与细胞进行组织培养显示，高剂量条件下（1000菌影/细胞），菌影仍不会造成细胞毒性或遗传毒性。菌影的来源与递送方式直接影响菌影的使用效果。有研究表明，出血性大肠杆菌菌影应用直肠免疫，能使动物能获取100%的免疫。Hps通过注射免疫，可引起猪DC表面表达共刺激分子和MHC分子明显增加。因此，对不同菌影候选疫苗的剂量和免疫途径还需要更多的深入研究。

5 展望

菌影的研究与应用不仅可减少动物细菌性病菌预防与治疗时抗生素的使用，还为动物用新型疫苗的研制提供了新的模式，其在未来动物疫病疫苗及免疫促进等方面具有广阔的发展前景。目前，菌影在猪生产中试验效果较好，但应用较少见，这可能与菌影制备成本过高、有些细菌菌影制备困难有关。笔者认为，未来菌影在猪只上的研究将逐步增多，菌影产品工艺也将不断改良，规模化生产使得菌影成本降低。适宜成本的菌影将在猪疫病的综合防控上表现出更加理想的价值，甚至可制备成动物保健产品应用于猪生产中。

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S816.73

A

1673-4645(2017)09-0054-05

2017-05-04

邓奇风（1990-），男，湖南娄底人，硕士，主要从事饲料配方技术研究，E-m ail：1204194718@qq.com

*通讯作者：刘志强（1979-），男，博士，E-mail：liuzhiqiangxy@126.com