免疫胶体金技术在动物疫病诊断领域中的专利进展

哈登楚日亚，赵永刚，赵 明，吴晓东，吴树清，王志亮

（1.内蒙古农业大学，内蒙古呼和浩特 010018；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；3.青岛市动物疫病预防控制中心，山东青岛 266100）

免疫胶体金技术在动物疫病诊断领域中的专利进展

哈登楚日亚1，2，赵永刚2，赵 明3，吴晓东2，吴树清1，王志亮2

（1.内蒙古农业大学，内蒙古呼和浩特 010018；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；3.青岛市动物疫病预防控制中心，山东青岛 266100）

免疫胶体金技术（GICT）现已广泛应用于各检测领域。本文通过检索我国国家知识产权局专利数据库，介绍了该技术的原理和特点，分析了其在病毒、细菌和寄生虫检测等方面的应用，并对我国免疫胶体金技术在动物疫病检测领域中的专利进展进行了综述。

动物疫病；免疫胶体金技术；专利；检测；应用

胶体金，又称胶体纳米金，是一种新型免疫学检测技术，其操作简便、特异性强、制作成本低、无需特殊仪器，是纳米诊断中最稳定的材料之一[1]。1959年，美国学者Yalow和Berson首次发明放射免疫技术，在此基础上，后期又出现了酶联免疫标记、荧光免疫标记、同位素免疫标记、乳胶免疫标记，以及胶体金免疫标记技术等多项标记技术[2]。1962年，Feldherr和Marshall首次将胶体金颗粒作为电子显微镜下的示踪标志。1971年，Faulk和Taylor[3]将胶体金作为标记物应用于免疫学，免疫胶体金技术由此广泛应用于疾病诊断领域。本文通过介绍免疫胶体金技术的原理、特点，以及我国免疫胶体金的相关专利情况，以期为该技术在动物疫病诊断检测中的应用发展提供参考。

1 胶体金技术原理及特点

1.1 胶体金技术的原理

胶体金的原理是通过还原剂将氯金酸（HAuCl4）溶液中的金离子（Au3+）转化为金原子，生成大小不同的胶体金颗粒。因该颗粒的电子密度高，在显微镜下，蛋白与标记物结合处可见黑褐色颗粒，当这些颗粒大量聚集时，肉眼可见红色斑点。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质的正电荷基团牢固结合。由于这种结合是静电结合，因此不会影响蛋白质的生物学特性。除与蛋白质静电结合外，胶体金还可以与多种毒素、抗生素、激素等非共价结合[4]。在动物疫病诊断中，最常用到的是斑点金免疫渗滤法（DIGFA）和胶体金免疫层析法（GICA）。这两种方法都是将待检样品加入抗原或抗体中，经过渗滤作用或毛细管作用使两者结合，再使用胶体金进行标记[5]。例如，在免疫层析试纸条检测中，首先将被检样品与金标抗体结合，形成抗原抗体复合物；其次前进到检测线时，被检样品和金标抗体复合物与已知抗体形成复合物，即双抗夹心；最后到质控线处，形成金标抗体与抗金标抗体复合物。

1.2 免疫胶体金的技术特点

1.2.1 易操作。不需任何特殊实验仪器或试剂，减少了检测时间，降低了操作误差，提高了工作效率。

1.2.2 检测面广。免疫胶体金技术既可以检测抗原，又可以检测抗体，这给检测提供了较多选择。

1.2.3 应用广泛。免疫胶体金技术可应用于电镜、生物传感器、疾病快速诊断、兽药残留检测、重金属残留检测、智能健康检测、毒品检测、古代丝织品等方面。

1.2.4 准确率高。免疫胶体金自身具有高特异性和高敏感性，可以确保检验的准确率。

1.2.5 制作成本低，反应迅速。制作耗材、使用样本量、试剂用量等相对较少，只需5～10 min，就可直接用肉眼判断检测结果。

2 应用

登陆中华人民共和国国家知识产权局专利数据库，对关键词“免疫胶体金”进行检索，可检索到1995—2016年的相关专利512项，其中已授权专利191项。按申请日统计显示，在2000年以后，申请免疫胶体金的相关专利数总体呈上升趋势（图1）。发明专利中，涉及动物病原微生物检测的比例最高，为31.45%，植物病原微生物检测的占14.06%，人类病原微生物检测的占13.28%，药物、抗生素残留检测的占24.80%，激素、添加剂检测的占11.52%，其他（如检测重金属、毒品、古代丝织品等）占14.06%。其中，检测的动物病原微生物包括病毒、细菌、寄生虫、霉形体等（图2）。

2.1 病毒检测

图1 我国免疫胶体金相关专利申请情况（截至2016年7月）

图2 我国免疫胶体金相关专利技术领域分类（截至2016年7月）

在病毒检测方面，金梅林等[6]发明了猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒，对200份猪肺脏样品进行检测，并检出的7份阳性样品进行病毒分离验证，结果全部分离出病毒，说明该试剂盒检测猪肺脏样品的特异性为100%。栗绍文等[7]发明的猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）胶体金抗体检测试纸条可在5～10 min内判定结果，将PRRS标准阳性血清分别倍比稀释至1:2 048，各取100 µL稀释的样品，按该发明方法进行试验的同时，用PRRS间接ELISA试剂盒进行对比检测。结果表明，该试纸条灵敏度接近间接ELISA，实验结果均达到28（体积比1:256稀释）。吴斌等[8]发明了一种检测猪伪狂犬病毒（PRV）gE血清抗体的试纸卡。该试纸卡操作简便、快速，结果直观、准确、灵敏度高，有较好的稳定性。将该试纸条分别置于室温和4 ℃，每隔一个月取出，同时检测10份PRV gE阳性血清和10份阴性血清样本，结果与预期结果一致，6个月后在室温和4 ℃保存的试纸条仍较为稳定。杨少华等[9]发明了一种基于新城疫病毒（NDV）血凝素蛋白单克隆抗体的胶体金免疫层析检测试纸条，对53份样品进行检测，结果显示，阳性率为22.60%，血凝抑制试验结果显示阳性率为26.40%，两者符合率为96.20%。

目前，分别对猪流感病毒、猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、口蹄疫病毒、猪2型细环病毒、猪流行性腹泻病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、J亚群禽白血病病毒、鸭坦布苏病毒、鸡传染性贫血病毒、鸡传染性法氏囊病毒、狂犬病毒、犬瘟热病毒、细小病毒、小反刍兽疫病毒、登革热病毒、牛病毒性腹泻病毒、疱疹病毒、家蚕核型多角体病毒、白斑综合征病毒、拟穴青蟹呼肠孤病毒等发明了免疫胶体金快速检测方法，已证实具有良好的特异性、敏感性和检测速度（表1）。

2.2 细菌检测

闫广谋等[10]发明了一种布鲁氏菌抗体免疫胶体金检测试纸条，对89份牛血清与虎红平板凝集试验进行对比检测，结果虎红平板凝集试验检出13份阳性，试纸条15份阳性，两种实验符合率为86.40%；将虎红平板凝集试验检测为阳性的血清用试纸条检测全部为阳性，两者符合率为100%。葛海鹏等[11]发明了一种检测霍乱弧菌的免疫层析试纸条，其制备方法简单，检测速度快，成本低廉。该试纸条可用于检测106～107CFU/mL的霍乱弧菌菌悬液标本，并且不与其他生物发生交叉反应，具有较高的敏感性及特异性。端青等[12]发明的一种检测炭疽芽孢杆菌的免疫层析试纸条具有良好的稳定性和特异性，对枯草杆菌、苏云金杆菌等8种相关细菌进行检测，结果均显示为阴性，而对制备好的包被有炭疽芽孢杆菌的兔多克隆抗体和羊抗兔IgG显示阳性。郭爱珍等[13]发明了牛结核抗体鉴别试纸条，对200份临床牛血清进行检测，并且与结核菌素试验（TST检测）作比较。结果TST检出阳性牛100头，试纸条检出阳性牛85头，阳性符合率为68.00%；TST阴性牛100头，试纸条阴性牛115头，阴性符合率为83.00%，总符合率为75.50%。

表1 免疫胶体金检测动物疫病病原微生物专利统计

目前，免疫胶体金检测技术在布鲁氏菌、牛结核杆菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、鸭疫里默杆菌、鳗弧菌、出血性大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌、副鸡禽杆菌、空肠弯曲菌、炭疽杆菌、李斯特菌、土拉热弗朗西斯菌、破伤风杆菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌等多种致病菌上均有涉及，与其他检测技术相比明显缩短了检测时间，灵敏性和特异性也相对较高（表1）。

2.3 寄生虫检测

宫鹏涛等[14]发明了一种微小隐孢子虫免疫胶体金检测试纸条，对已处理好的含安氏隐孢子虫、蓝氏贾第虫、柔嫩艾美尔球虫和微小隐孢子虫粪便进行检测，结果显示，该试纸条只对微小隐孢子虫检测呈阳性，其他均为阴性，说明其具有良好的特异性。用在4 ℃环境中保存的试纸条对标准阳性样本进行定期检测，结果显示，4 ℃保存60天后，试纸仍均呈稳定的阳性反应。余新炳等[15]发明的华支睾吸虫免疫胶体金试剂盒操作简单快速，检测结果清楚易于判断，特异性强、敏感性高，无需仪器设备或只需简单的仪器，非常适于发病现场、门诊等的临床样品检测使用。刘志杰等[16]发明的检测羊泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条与rTuIPELISA同时检测127份样品，两者同时检出40份阴性样品，阴性符合率为100%；两者共检出阳性样品87份，其中试纸条检出81份，阳性符合率为93.10%。这说明该试纸条具有较好的检测性能，能够完全满足基层实验室和兽医从业者的使用。目前对小隐孢子虫、羊泰勒虫、疟原虫、华支睾吸虫、弓形虫等寄生虫病均发明了免疫胶体金检测方法，已证实其特异性和敏感性较高，且比其他检测方法更简便快速（表1）。

3 小结

关于免疫胶体金技术在动物疫病诊断中的应用进展，已有多篇文章进行了报道。如秦立得等[17]的胶体金免疫层析试纸条在禽病检测方面的应用与展望，庄金秋等[18]的胶体金免疫层析技术在兽医临床诊断中的应用进展等，都是以国内外最新研究情况为参考进行的综述。而本文主要是通过检索国家知识产权局专利数据库，围绕免疫胶体金检测技术专利注册方面，对其在动物疫病诊断上的应用进行归纳和总结。

免疫胶体金技术是一种新型检测方式。多类文献报道表明，该技术相对于ELISA、HA、AGP等其他检测技术，具有特异性高、样本用量少、检测速度快、操作简单、不需任何特殊仪器设备等优点。该技术在多个检测领域中已得到广泛应用，涉及病原体、药物、激素、毒品、重金属、丝织品等方面。自2000年以来，该技术的相关专利申请数总体呈上升趋势。该技术的申请专利中，涉及病毒、细菌、寄生虫等动物疫病病原体检测的专利共计161项，占总数的31.45%，其中动物疫病检测是一个主要发展方向。然而，该技术在实际应用中仍存在一些问题，如假阴性结果多、检测范围有限、灵敏度低等。柳爱春[19]发明了一种半定量免疫胶体金试纸条，能够对食用农产品中氟喹诺酮类药物残留量实现半定量快速检测或现场检测。该试纸条灵敏度高、特异性好，对农产品中16种氟喹诺酮类药物的最低检出限可达1～10 µg·kg-1，适用于各类企业及检测机构，对青霉素、氯霉素、链霉素、四环素或磺胺嘧啶等抗菌素的交叉反应率均低于1%。Jelinek等[20]报道过免疫胶体金检测技术出现假阳性问题。新型免疫胶体金技术在此基础上进行了改进，并在较大程度上克服了这一问题。李溢军[21]发明的一种四联（猪瘟、猪伪狂犬病、猪蓝耳病和猪口蹄疫）抗体快速金标测试卡，其不仅可以同时检测出4种不同病毒抗体，而且操作简单，样品用量较少。

免疫胶体金技术是动物疫病快速检测领域的一个主要发展方向和模式。若该技术能进一步提高其特异性和灵敏度，减少假阳性和假阴性数量等问题，在动物疫病检测领域中，其将有更广阔的应用前景。

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[21]李溢军. 一种四联对猪瘟、猪伪狂犬、猪蓝耳和猪口蹄疫抗体快速金标测试卡：201420767358.2[P].2015-06-03.

（责任编辑：杜宪）

Patent Progress on Immune Colloidal Gold Technique （GICT）in Animal Diseases Diagnosis

Hadengchuriya1，2，Zhao Yonggang2，Zhao Ming3，Wu Xiaodong2，Wu Shuqing1，Wang Zhiliang1
（1. Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot，Inner Mongolia 010018；2. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；3. Qingdao Animal Disease Prevention and Control Center，Qingdao，Shandong 266100）

At present，immune colloidal gold technique（GICT）has been applied in the feld of detection widely. By retrieving data from patent database of the State Intellectual Property Offce of China，the principles and characteristics of GICT were introduced，and its use in detecting viruses，bacteria and parasites was analyzed. Meanwhile，the parent progress on GICT in diagnosis of animal diseases in China was summarized.

animal disease；immune colloidal gold technique（GICT）；patent；detection；application

book=81,ebook=87

S851.34

A

1005-944X（2017）01-0081-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.01.023

“十三五”国家重点研发计划（2016YFD0501104）

吴树清、王志亮