染色体畸变分析估算生物剂量的实践与体会

2017-01-14荣曙于旭毛应华杨龙

灾害医学与救援(电子版) 2017年1期

关键词：畸变染色体剂量

荣曙，于旭，毛应华，杨龙

染色体畸变分析估算生物剂量的实践与体会

荣曙，于旭，毛应华，杨龙

本文结合疾病预防控制中心医学防护所的日常工作，对染色体畸变分析估算生物剂量的应用和估算方法进行了简要介绍，分析了当前存在的主要问题，提出解决的对策。

染色体制备；染色体畸变分析；生物剂量估算；体会

近年来，随着核技术与核能的广泛应用，核与辐射事故的潜在危险悄然增加，再加上国内外加紧对核恐怖事件的防范，生物剂量估算在核战争、放射性事故、职业和大众的辐射安全和卫生防护等方面的重要性已被世界各国所认识和重视。染色体畸变分析用作生物剂量估算已有50多年的历史，可靠性已通过大量数据得到确认，被认为在事故剂量估算中是一种最可信赖的辐射生物计量方法。本文结合疾病预防控制中心医学防护所当前的工作任务，对染色体畸变分析估算生物剂量在日常工作中的应用和估算方法进行总结，将相关问题及建议报告如下。

1 染色体畸变分析在生物剂量估算中的应用

1.1 染色体畸变可作为小剂量辐射生物效应的特异性敏感指标随着人们对电离辐射认识的不断深入，辐射防护越来越受到重视，职业工作人员的防护意识也逐渐提高。放射工作人员所受的职业危害主要是长期的慢性小剂量电离辐射，一般认为，累积剂量低于100 mGy时，染色体畸变没有明显改变，当累积剂量大于100 mGy时，染色体畸变就可能明显增加[1]。但近年来，多家机构调查显示，不同工种放射工作人员的淋巴细胞染色体畸变率均高于正常人群，而且可能随着工龄的增加而逐渐增高[2-4]。因此，目前染色体畸变作为评价放射工作人员受照效应的一种简单而有价值的遗传学指标被应用于职业健康体检中。

1.2 染色体畸变分析在辐射事故中的应用生物剂量估算是核事故医学应急体系中非常重要的组成部分。用非稳定性染色体畸变估算事故受照者的生物剂量，在国内多次辐射事故处理过程中都起到了非常重要的作用[5-6]。辐射事故中，生物剂量可以和物理剂量互相验证，互相补充。当未佩戴个人剂量计、无法用物理方法提供剂量时，或者估算的物理剂量与临床表现不符合时，染色体畸变分析被认为是较为灵敏、估算剂量较可靠的首选方法。

2 染色体畸变分析估算生物剂量的方法

依据GBZ/T 248-2014《放射工作人员职业健康检查外周血淋巴细胞染色体畸变检测与评价》、GB/T 28236-2011《染色体畸变估算生物剂量方法》，参照相关专著[7-8]，并结合作者的实践总结如下。

2.1 外周血淋巴细胞染色体标本制备（1）采血：采集静脉血2 ml，予肝素抗凝。（2）培养：无菌条件下接种0.4 ml抗凝血至市售5 ml淋巴细胞培养液中，加入秋水仙素，使其浓度为0.03 mg/L，充分混匀，37℃恒温培养箱中培养48～52 h后收获。（3）低渗：终止培养后吸去上清培养液，加入预温37℃的0.075 mol/L氯化钾低渗液8 ml，移入离心管，混匀后置37℃水浴中放置30 min。（4）预固定：低渗取出后立即加入固定液（甲醇:冰醋酸＝3:1）1 ml轻轻混匀，1000 rpm离心10 min。（5）固定：吸去上清液，加入固定液8 ml混匀，室温静置30 min，然后1000 rpm离心10 min。弃固定液，以同样方法再固定一次。（6）制片：吸弃固定液，根据沉淀物多少加入少量固定液，混匀，静置10 min。将细胞悬液滴在冰水浸泡的玻片上，每片3滴，酒精灯上过火1～2次，然后自然干燥。（7）染色：Giemsa原液与磷酸缓冲液1:9混合配制染液，常规染色8 min左右，自来水冲洗玻片背面，置晾片架上晾干后待镜检。

2.2 染色体畸变分析在低倍镜下寻找分散良好、长短适中的分裂相，换用油镜对其进行仔细观察，分析和记录（46±1）个染色体的中期细胞。电离辐射诱发的畸变主要是染色体结构的改变，包括染色单体型畸变和染色体型畸变。由于大部分化学诱变剂和环境中一些有害因素均可诱发单体畸变，故一般认为单体型畸变对辐射效应评价意义不大。而染色体型畸变又可分为非稳定性畸变和稳定性畸变两类，前者包括双着丝粒（dic）、着丝粒环（r）和无着丝粒片段（ace），后者包括相互易位（t）、倒位（inv）和缺失（del）。放射工作人员职业健康检查时主要分析计数dic、r和ace，以及明显的非对称性的t和del等。辐射事故生物剂量估算时只计数dic或dic+r，ace作为辅助指标。

2.3 放射工作人员染色体畸变检测评价职业健康体检时，每名受检者至少分析100个中期分裂细胞。ace率大于3%，dic率、r率和t率大于或等于1%均为异常。作为慢性放射病诊断指标时还需至少增加分析100个中期分裂细胞。

2.4 辐射事故生物剂量估算根据镜检所得的dic或dic+r的畸变率，从相应射线所建立的刻度曲线回归方程估算受照剂量平均值，同时给出剂量范围的95%可信区间。对估算剂量的个体，至少分析300～500个中期分裂细胞。但当大剂量急性照射时，通常分析100～200个中期分裂细胞就可满足统计学要求。

3 染色体畸变分析估算生物剂量存在的难点及制定对策

3.1 染色体畸变标本制备成功的关键点染色体畸变是反映辐射损伤的良好指标，也是受人为影响很大的一项检查。染色体标本制备从采血、培养、制片到分析全部为人工操作，环节多，时间长，其中任何一个环节处置不当都会影响畸变细胞的检出率。应特别注意以下这些方面：（1）收获细胞前的所有步骤要保持无菌操作，防止污染。（2）加血量要适中。血液太少，细胞稀薄，细胞生长速度减慢；血液太多，会造成细胞营养不够，影响其生长状态。（3）秋水仙素的浓度和作用时间要准确控制。秋水仙素浓度过高，处理时间过长，不但产生细胞毒性作用使分裂相减少，而且染色体过于缩短，不宜进行分析；反之则不能有效阻断细胞分裂，染色体瘦长或无中期分裂相。（4）低渗浓度和时间要适当。低渗过度，可使核膜破裂，染色体丢失；低渗不足则细胞膨胀不够，染色体分散不开。（5）固定液要新鲜配制，否则会形成酯类，从而影响固定效果。（6）载玻片一定要非常干净，并且经0℃预冷，滴片时距离不小于50 cm，均有利于染色体的分散。此外，整个制备过程还需注意操作手法，减少不必要的细胞丢失。

3.2 染色体畸变分析估算生物剂量存在的问题（1）制片质量的优劣影响阅片效率和畸变的检出率。由于染色体实验影响因素众多，制片质量往往不稳定，特别是在季节交替、温湿度变化大的季节，或是某个试剂更换批次时，如不能及时调整实验条件，制片效果就会不近人意，从而影响染色体的显微观察。（2）不同经验的技术人员判定畸变的准确率差异大。判断染色体畸变需要分析人员有丰富的经验，一般有经验的分析人员dic+r畸变的准确率要高于新参加人员[9]。（3）多数实验室没有建立自己的剂量曲线。尽管用于生物剂量估算的染色体标本制备技术已有国家标准，对于畸变的描述也很清楚，但是这项技术完全是手工操作，尤其是畸变的判断也全凭个人经验，因此如果不是用自己建立的剂量曲线估算，即使是同一剂量的标本，不同实验室的估算结果也会有较大差异。

3.3 染色体畸变分析估算生物剂量难点制定对策（1）要想获得高质量的染色体片，必须做好染色体标本制备的质量控制工作。染色体畸变标本制备的每个环节都很重要，出现失误会影响最终制片效果，增加观察的难度和检查结果的偏离。因此必须从人员到设备、试剂、操作过程都严格按照质量手册规范，并不断完善和总结经验，做好室内质控。（2）培养稳定的团队，通过集中学习和培训，加强技术人员业务知识培训，使之熟练掌握染色体标本制备技术和判断、识别各种染色体畸变类型的能力，提高制片成功率和分析结果的准确率。目前，很多单位使用染色体自动扫描成像系统，这对制片和阅片的要求更高。（3）最大限度统一畸变分析标准，建立共同的剂量-效应曲线。原则上剂量-效应曲线的建立和剂量估算的分析人应为同一人，这样才能保证判断标准的统一，但实际情况一般不能满足该条件，这就需要实验室内部和实验室之间判断标准尽量一致。通过定期进行的实验室间比对进行质量控制，然后逐步建立起较为一致的剂量-效应曲线，不仅能够提升各实验室生物剂量估算能力，还可提高同一时期样本的处理量，为应对大规模核与辐射事故的医学救援工作做好技术准备。

[1]李秀芹，于瑞敏，赵进沛，等.染色体畸变研究方法及其在生物剂量估算中的应用[J].中国辐射卫生，2006，15（1）：116-117.

[2]刘征宇，杨学琴，惠长野，等.深圳市放射工作人员周围血淋巴细胞染色体畸变分析[J].职业与健康，2013，29（13）：1549-1551.

[3]周齐红，俞慧娟，付风云，等.放射工作人员外周血淋巴细胞染色体畸变和微核率分析[J].中华劳动卫生职业病杂志，2016，34（4）：275-277.

[4]周媛媛，王进，余宁乐，等.江苏省2642名放射工作人员外周血淋巴细胞染色体畸变及微核率分析[J].职业与健康，2016，32（14）：1891-1893.

[5]刘建香，黄敏燕，阮健磊，等.哈尔滨事故受照者的生物剂量估算[J].中华放射医学与防护杂志，2006，26（5）：460-462．

[6]秦永春，周献锋，熊晓芸，等.南京铱-192放射源丢失事故受照者生物剂量估算[J].中国职业医学，2016，43（3）：305-306.

[7]金璀珍.放射生物剂量估计[M].北京：军事医学科学出版社，2002，166-172.

[8]吴德昌.放射医学[M].北京：军事医学科学出版社，2001，129-132.

[9]阮健磊，陆雪，陈德清，等.2007年全国染色体畸变分析估算辐射生物剂量比对[J].中国辐射卫生，2008，17（3）：259-261.

（收稿：2016-11-10修回：2016-12-26编校：丁艳玲）

2095-3496（2017）01-0040-03

10.19372/j.cnki.issn.2095-3496.2017.01.016