MicroRNA在强直性脊柱炎成骨、破骨机制中的作用

杨文雪 夏启胜 陶庆文 周童亮 张兰 陈志华 阎小萍 孔维萍*

1. 北京中医药大学，北京 100029 2. 中日友好医院临床医学研究所，北京 100029 3. 中日友好医院中医风湿病科，免疫炎性疾病北京市重点实验室，北京 100029

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种以骶髂关节及脊柱中轴关节为主要病变的慢性进行性炎症性疾病[1]。尤其以骶髂关节、脊柱及外周关节(尤其是髋关节) 骨化强直和外周附着点病理性成骨为特点，脊柱和关节骨化强直是AS患者致残的主要原因。目前，AS病因尚不明确，大多研究认为与遗传、感染、免疫、环境因素等有关。

微小RNA(Micro RNA，miRNA)是近年来研究的一个热点，越来越多的研究表明miRNA调节成骨细胞、软骨细胞和破骨细胞的分化与功能，提示miRNA是骨形成、吸收、重塑和修复过程中的关键调节因子。而AS的典型病理改变为炎症、骨破坏和新骨形成[1]。本综述着重介绍与miRNA在强直性脊柱炎的成骨、破骨等过程中的作用相关的研究进展。

miRNA是长度为20～22bp的高度保守的小分子非编码RNA，最早是1993年Lee等人[2]在秀丽隐杆线虫的线粒体中发现的。一般认为，miRNA的产生首先是在细胞核内形成初级前体(pri-miRNA)，pri-miRNA在核酸酶和辅助因子的作用下形成miRNA前体(pre-miRNA)。随后，pre-miRNA被转运到细胞质中，经另一种核酸酶剪切形成miRNA*双链。这种双链结构在解旋酶的作用下解旋成两条链，其中一条链被降解，通常5’端碱基配对不稳定的另一条链则结合多种蛋白质因子形成沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)[3]，与靶mRNA进行碱基互补配对，形成部分配对的miRNA-mRNA双链分子，通过类似RNAi(RNA interference)的机制，抑制翻译或降解mRNA，对基因进行转录后水平调控。从1993年首次在线粒体内发现 miRNA，到现在已发现miRNA 28645种，存在于人体内的有2661种[4]，它可能调控着至少 1/3的人类编码蛋白基因。miRNA的表达异常或与mRNA结合力的异常会使基因表达失控，引起各种疾病。已经有较多研究验证 miRNA参与了多个系统疾病的发生发展，包括肿瘤、自身免疫性疾病及心功能不全等，且 Mitchell等[5]和Gilad 等[6]的检测结果表明血浆中的内源 miRNA 分子和血清miRNA不仅为各种常见病种和疑难杂症的研究开阔了思路和方向，并且其本身就具有极好的生物标志物的潜力。

1 miRNA在成骨机制中的作用

成骨细胞中的miRNA对成骨细胞分化和调节骨形成起关键作用，初步研究已经证实了骨组织中许多特定miRNAs的功能活性。AS的成骨过程主要与经典wnt通路、BMP通路相关。

1.1 miRNA在经典wnt通路中的作用

Wnt蛋白及其受体、调节蛋白等组成的复杂信号转导通路，包括Wnt/β-catenin经典信号通路、Wnt/平行极性、Wnt/Ca2+、调节纺锤体定向和不对称细胞分类信号的非经典通路。其中经典通路是介导成骨过程的关键[7]。在经典Wnt信号通路中Wnt蛋白(Wnt1、Wnt3a、Wnt8a、Wnt10b)等与细胞跨膜特异性受体卷曲蛋白(frizzled，Frz)及辅助受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LDL-receptor-related protein5/6，LRP5/6)结合后，从而抑制β-catenin降解复合物的活性，使细胞内β-catenin水平升高，启动下游靶基因转录。Dickkopf1(DKK1)是经典Wnt信号通路的抑制因子，其能够钝化LRP5/6，减弱Wnt蛋白与LRP5/6的结合，从而抑制经典Wnt信号通路的激活[8]。

大量研究表明miR-29a在成骨分化过程中起关键作用，与强直性脊柱炎密切相关。研究证实miR-29a在成骨细胞分化过程中表达上调，其激活位点为经典Wnt通路中信号分子T细胞因子/淋巴样增强因子-1；增强miR-29a表达后能有效下调经典Wnt信号通路的抑制剂DKK1，进而强化Wnt信号通路。提示DKK1是miR-29a的作用靶点，miR-29a通过下调DKK1从而激活经典Wnt信号通路促进成骨细胞分化[9]。Huang等[10]研究发现AS患者miR-29a表达较类风湿关节炎患者及健康对照组显著增高，并与AS新骨形成放射学评分(the modified stoke ankylosing spondylitis spine score，mSASSS)成正相关，但与疾病活动性无关。扶忠超等[11]发现miR-29a在AS患者PMBC中高表达，与Wnt/β-catenin通路中Dkk-1、GSK-3β的表达呈负相关，与β-catenin表达呈正相关，伴随着成骨相关基因Runx2的高表达，miR-29a可能通过下调Dkk-1调控Wnt/β-catenin通路参与AS新骨形成。AS患者的PBMCs中miR-29a相对表达量与β-catenin、Runx2、病程、mSASSS呈正相关，与Dkk-1、GSK-3β呈负相关；病程与mSASSS亦呈正相关，miR-29a与血清中CRP、ESR均无相关性。然而，也有研究发现miR-29a下调，如Li等[12]发现miR-29a在AS患者中显著下调，miR-29a主要以DKK1和GSK3β为靶点调节TNF-α介导的骨丢失，从而激活wnt/β-catenin信号通路。另有研究发现[13]未经依那西普治疗的活动期AS患者中的miR-29a较对照组显著降低，但经过12w依那西普治疗后miR-29a显著上调。研究结果的差异可能和种族、生活方式、样本量大小等因素有关。

Zhang等[14]研究证实miR-335-5p通过作用于DKK1的3’UTR端来下调DKK1，导致wnt通路增强，GSK3β磷酸化作用和β-catenin转录活性增强，从而调节成骨分化；而经过抗miR-335-5p治疗后miR-335-5p的作用被颠倒，并且可以下调内生的miR-335-5p。Lin等[15]发现miR-335-5p和它的寄主基因(host gene)Mest共表达，并且在小鼠MSC软骨生成中显著上调。miR-335-5p过表达导致软骨生成标志基因表达增加；分子机制研究发现miR-335-5p的靶基因是Daam1和ROCK1，一组Sox9的负调节因子；Sox9下调miR-29a和miR-29b的表达，同时负调节Mest的表达；因此形成一个从miR-335-5p到Sox9再到Mest/miR-335-5p的正反馈循环。在mMSC软骨分化过程中miR-335-5p以DKK1为靶点增加β-catenin/TCF活性，导致Mest转录水平增加。

miR-218也是促进成骨细胞分化的wnt通路的强大的激活者。miR-218在成骨细胞和骨的转移癌细胞中高表达，以wnt的3种抑制剂：Sclerostin、DKK1和SFRP2为靶点，通过减少它们的表达来激活wnt通路，并激活自身放大正调节回路[16]。

经典wnt在骨形成的不同阶段都起作用，miR-27在成骨细胞分化和骨形成中起关键作用。Wang等[17]研究发现miR-27在hFOB1.19细胞分化过程中表达增高，miR-27的异常表达促进hFOB1.19细胞分化，而抑制miR-27则使细胞分化受到抑制；miR-27的表达水平与β-catenin蛋白呈正相关；miR-27以APC为靶点并抑制其表达，通过使β-catenin积累来激活wnt通路。而Guo等[18]则发现在hPOB1.19细胞增殖和成骨分化过程中外源的miR-27a可以显著抑制sFRP1的mRNA和蛋白水平；miR-27过表达或者敲除sFRP1可以显著增加hFOB的凋亡率、细胞周期在G2-M期的百分率、关键成骨分化标志(ALP、SPP1、Runx2、ALP活性)的表达，并使hFOB中的β-catenin积累。证明miR-27通过抑制sFRP1的转录水平表达来促进成骨细胞分化。

1.2 miRNA在BMP通路中的作用

骨形态生成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)/Smads信号传导通路目前被认为是强直性脊柱炎病理成骨的一条重要途径。BMP是转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的一员[19]，通过激活Smads蛋白将TGF-β信号由细胞膜转至细胞核，诱导核内成骨基因表达，使组织纤维化、骨化。迄今发现的约20 多种BMP 成员中，以BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7和BMP-9在成骨作用方面尤为重要。Runx是调控间充质干细胞向成骨细胞分化的特异性转录因子，包括Runx1、2和3，特别是Runx2是BMP-2的靶基因，是骨髓间充质干细胞和成骨细胞(osteoblast，OB)分化、骨发育的重要调节因子[20]。近年来，多种与 BMP信号通路相关的小RNA被报道，它们或积极或消极的调节成骨细胞分化[21]。

Zhang等[22]发现了一系列调控Runx2成骨活性和影响成骨细胞成熟的miRNAs，包括miR-23a、miR-30c、miR-34c、miR-133a、miR-135a、miR-137、miR-204、miR-205、miR-217和miR-338，证实这些miRNA与Runx2表达量相反，可直接减少Runx2的蛋白积聚。

Chen等[23]研究发现miR-23b在BMP9诱导的C2C12成肌细胞中显著下调。在C2C12成肌细胞中miR-23b过表达能够显著抑制成骨分化；另外，研究发现miR-23b通过作用于Runx2 3′UTR的特定位点来负调节Runx2的转录后水平。敲除C2C12成肌细胞中的Runx2能促进miR-23b诱导的成骨分化抑制。在成骨细胞系中Runx2通常是上调的，与miR-23b的表达刚好相反。因此认为miR-23b以Runx2基因为靶点抑制BMP9诱导的C2C12成肌细胞成骨分化。在BMP2介导的C2C12成骨分化过程中与成骨分化相关的miRNAs被下调[24]，其中miR-133、miR-135分别以Runx2和Smad5为靶点调节成骨分化(Runx2是骨形成过程中早期必需的BMP反应基因，Smad5是BMP2成骨信号的关键传感器)。

Zeng等[25]的研究显示miR-100过表达可以抑制体外人脂肪来源间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells，hASCs)的成骨分化，而miR-100下调则促进此过程。靶点预测分析和双重荧光素酶报告基因证实miR-100的直接靶基因为BMPⅡ型受体(BMP receptor type Ⅱ，BMPR2)。通过RNA干扰敲除BMPR2抑制hASCs的成骨分化，与miR-100上调的作用类似。

Pais等[26]在蛋白水平上发现miR-140通过抑制Smad3来抑制TGFβ通路，而TGFβ可以抑制miR-140的积聚，由此形成一个双重的负反馈循环。

众多研究表明[27-28]，noggin蛋白为BMP通路的一种拮抗剂，miRNA也通过noggin来调节BMP通路。Ning等[29]发现noggin3是miR-92a的直接作用靶点：mir-92a失活使noggin3水平稳定，导致BMP信号通路和软骨细胞形成受到抑制；相反，miR-92a异位表达使noggin3 mRNA的水平加倍降低，结果抑制BMP通路并促进细胞凋亡。

2 miRNA在破骨机制中的作用

2.1 miRNA与RANKL/RANK/OPG系统的关系

由细胞核因子KB受体活化因子配体(receptor activator of NF-KB ligand，RANKL)、细胞核因子KB受体活化因子(receptor activator of NF-KB，RANK)和护骨素(osteoprotegerin，OPG)组成的RANKL/RANK/OPG系统近些年来被发现在AS骨代谢和骨损伤的机制中起着重要作用。RANKL、RANK、OPG 3者同属于肿瘤坏死因子超家族。

Shi等[30]发现miR-17/20a能显著降低RANKL蛋白水平，并减少成骨细胞中地塞米松诱导的RANKL表达，荧光素酶报告进一步证实了miR-17/20a抑制RANKL蛋白的后期转录；在破骨细胞和miR-17/20a过表达的成骨细胞共培养的条件下，地塞米松诱导破骨细胞分化和功能的能力明显下降。

2.2 miRNA对破骨细胞的影响

有研究发现[31]在破骨细胞分化的各个阶段有37种miRNA发生改变，其中22种上调，15种下调。Waki等[32]发现在标准骨折愈合的第14天，5种miRNAs(miR-140-3p、miR-140-5p、miR-181a-5p、miR-181d-5p、miR-451a)与不愈合的骨折相比显著升高。

Zhao等[33]研究表明miR-214在破骨细胞分化过程中起关键作用，骨髓单核细胞(bone marrow monocytes，BMMs)中miR-214过表达促进破骨细胞生成，反之则抑制。miR-214通过P13K/Akt通路发挥作用。进一步体内研究显示，破骨细胞特定miR-214转基因小鼠(osteoclast specific miR-214 transgenic mice，OC-TG214)中抑癌基因水平下调，破骨细胞活性增加，骨密度降低。

Huang 等[34]发现AS患者中miR-21、程序性细胞凋亡4(programmed cell death 4，PDCD4)mRNA和胶原交联C端肽(collagen cross-linked C-telopeptide，CTX)表达显著升高；未服用NSAID和DMARD药的强直性脊柱炎患者miR-21与PDCD4 mRNA呈负相关，而服用柳氮的强直性脊柱炎患者的miR-21与PDCD mRNA和CTX却呈正相关；miR-21与CTX的水平与病程和活动性呈正相关。

3 miRNA与炎症因子的关系

let-7i在强直性脊柱炎患者的T细胞中过表达，并与腰椎BASRI呈正相关，其靶基因蛋白TLR-4在强直性脊柱炎患者的T细胞中减少，而IFN-γ mRNA在AS的T细胞中升高[35]。Hou等[36]也发现AS患者T细胞中let-7i表达上调，而胰岛素样生长因子1受体(insulin like growth factor-1 receptor，IGF1R)表达下调(IGF1R位于T细胞表面，决定T细胞的激活，IGF1R高水平对于维持T细胞活性至关重要)，进一步研究表明IGF1R是let-7i的直接作用靶点，而let-7i能够显著抑制IGF1R的表达，IGF1R抑制导致细胞自噬。因此，小RNA let-7i通过IGF1R诱导细胞自噬来保护T细胞免于细胞凋亡。Niimoto 等[37]研究发现6种小RNA(let-7a、miR-26、miR-146a/b、miR-150和miR-155)在产生IL-17的T细胞中显著升高，其中miR-146a与IL-17的关系更加密切。Kärner等[38]研究发现在产生IL-22的T细胞中miR-323-3p表达升高而miR-93、miR-181a、miR-26a和miR-874表达下调，分析表明这些不同表达的小RNA可以影响T细胞的增长、分化和功能；在IL-22和IL-17双阳性的T细胞中miR-323-3p表达最高，它可以抑制TGF-β通路的多种基因，并抑制T细胞分泌IL-22。

miR-155通过诱导促炎性因子TNF生成来促进炎症[39]。与此研究一致，miR-155缺陷的小鼠不会得胶原诱导性关节炎[40]。Li 等[41]研究发现miR-130a与TNF-α呈强负相关，在软骨细胞中，miR-130a功能缺失增加TNF-α的表达，并促进炎症发生。

4 小结

近年来，miRNA在AS发病机制中的作用已取得了一定的进展，多种miRNA通过影响成骨通路如wnt/β-catenin信号通路及BMP/Smads通路、破骨机制如RANKL/RANK/OPG系统及破骨细胞以及炎性因子等多个方面对强直性脊柱炎成骨、破骨的发生发展发挥重要作用。虽然多篇文献报道miRNA的表达谱存在改变，但目前这类结果仍然缺乏一致性，对于一种miRNA可调控多少种蛋白的表达仍不明确。随着研究的深入，miRNA调控AS的机制必将进一步得到揭示，miRNA对AS的诊断和治疗必将产生重要意义。